[发明专利]一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法

权利要求书

1.一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.DNA提取：从油菜种子或者叶片中提取基因组DNA；

S2.KASP引物合成：基于现有油菜品种基因的DNA序列，共获得SNP位点，开发出KASP引物；所述SNP位点是psbA基因第790位；

S3.KASP反应：将提取的DNA配制PCR反应体系进行PCR扩增反应，反应结束后，根据检测的荧光信号来判断样本分型情况，根据不同的荧光信号获得不同的基因型，包括TT型油菜、TS型油菜和TS/TT的杂合型；

S4.耐受型油菜的鉴别：其中TT型油菜和TS/TT的杂合型判断为耐受型油菜。

2.根据权利要求1所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，其特征在于，步骤S2中所述KASP引物包括BN-TT.1和BN-TT.2；所述BN-TT.1和BN-TT.2均包括两条特异性引物和一条通用引物。

3.根据权利要求2所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，所述BN-TT.1的Primer_Allele X特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述BN-TT.1的Primer_Allele Y特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述BN-TT.1的通用引物Primer_C的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.根据权利要求2所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，所述BN-TT.2的Primer_Allele X特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述BN-TT.2的Primer_Allele Y特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述BN-TT.2的通用引物Primer_C的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

5.根据权利要求1所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，步骤S3中所述PCR反应体系如下：

100 μM Primer_Allele X：0.003μl；

100 μM Primer_Allele Y：0.0013μl；

100 μM Primer_C：0.0013μl；

2x KASP Master Mix：0.3945μl；

超纯水：补足至0.8μl。

6.根据权利要求1所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，步骤S3中所述PCR扩增条件如下：94℃15min；94℃ 20s，65℃-57℃退火60s，10个循环，每个循环退火温度降低0.8℃；94℃20s，57℃60s，30个循环。

7.根据权利要求1所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，步骤S3中所述不同的荧光信号检测中，如果样品PCR产物只检测到引物Primer_Allele X对应荧光信号，则检测位点为碱基A，判定待测材料为纯合不耐受型油菜；若只检测到引物Primer_Allele Y对应荧光信号，则检测位点为碱基G，判定待测材料为TT型油菜；若同时检测到两种荧光信号，则检测位点为A：G，判断待测材料为TS/TT的杂合型油菜。

8.根据权利要求7所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，步骤S3中所述不同的荧光信号检测结果中，位于右下角的为TT型油菜，位于左上角的为TS型油菜，位于中间的为TS/TT的杂合型油菜。

9.根据权利要求1所述高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，KASP反应和验证用Array Tape系统进行，包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增反应的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。