[发明专利]一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法

说明书

本发明提出了一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，属于农业技术领域。包括：S1.从油菜种子或者叶片中提取基因组DNA；S2.基于现有油菜品种基因的DNA序列，共获得若干SNP位点，开发出KASP引物；S3.将提取的DNA配制PCR反应体系进行PCR扩增反应，反应结束后，根据检测的荧光信号来判断样本分型情况，根据不同的荧光信号获得不同的基因型，包括TT型油菜、TS型油菜和TS/TT的杂合型；S4.TT型油菜和TS/TT的杂合型判断为耐受型油菜。可用于种子和叶片材料的检测，利用自动化仪器检测通量高，一天内可完成上万份材料的检测，成本低于现有的分子检测方法。

技术领域

本发明涉及农业技术领域，具体涉及一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法。

背景技术

油菜是重要的食用油料作物之一,种植面积广泛,但油菜田的草害严重影响油菜的产量和品质。杂草危害可使我国油菜籽产量下降15.8%,严重的田块减产幅度可达50%以上[Song et al. 2005]。使用化学除草剂是目前最为主要的除草方法，而三嗪类除草剂津是在世界范围内广泛应用的一种除草剂之一。但除草剂施用不当会造成油菜不同程度的药害,从而影响油菜的生长发育与产量,因此选育三嗪类除草剂耐受（TT）型油菜，是油菜生产实现除草化学化的有效途径之一。

三嗪类除草剂的作用机理是取代质体醌与叶绿体类囊体膜上的32KD蛋白结合，从而阻断了PSⅡ的光电子传递而使光合作用受阻[John et al. 1982]。32KD蛋白由叶绿体psbA基因编码的，psbA基因第790位上A碱基突变为G碱基，会导致第264氨基酸由丝氨酸（AGT）突变为甘氨酸（GGT），从而丧失与三嗪类化合物的结合能力，形成了三嗪类除草剂耐受性[M.Reith et al. 1987]。因此通过检测psbA基因第790位上碱基类型，就能鉴定出三嗪类除草剂耐受（TT）型油菜。

传统鉴定三嗪类抗除草剂耐受型（TT）型油菜的方法是田间小区种植鉴定法。田间种植油菜，在幼苗期施用三嗪类抗除草剂，看幼苗存活情况鉴定除草剂耐受性，此方法易受环境和栽培条件影响，准确性和稳定性差；耗时长、时效性差；需投入大量人力、物力，成本高。

三嗪类抗除草剂耐受型（TT）型油菜的分子检测方法不受环境和材料生长周期限制，可以在种子期完成检测鉴定，目前的TT型油菜的分子检测方法有：Southern杂交法[Wing et al. 1993] 、测序法[Michaela et al. 1993] 、PCR与MaeⅠ酶相结合的方法[Wing et al. 1993]、直接PCR法[翟文学等，1993 Xin et al. 2006]、荧光PCR法[Peeret al. 2009]。Southern杂交法检测周期长、通量低；测序法准确率高，但检测周期长，检测效率和检测通量低，且费用也高；PCR与MaeⅠ酶相结合的方法检测过程较长通量低，MaeⅠ酶价格较高，检测性费用高；直接PCR技术快速便宜，但需要进行凝胶电泳检测，检测过程使用的核酸染料等试剂对环境及人体有危害，且自动化程度低检测通量小；荧光PCR通量略高于直接PCR法，但检测成本较高的问题。

因此，针对播种前就要完成成千上万份的大量油菜除草剂耐受性的鉴定，目前没有一种快速、高效、低成本、精准的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提出一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，可应用于种子材料的检测，能在播种前完成检测鉴定，利用自动化仪器检测通量高，一天内可完成上万份材料的检测，反应体系小成本低于现有的分子检测方法，实现快速、高效、低成本、精准检测鉴定三嗪类除草剂耐受型（TT）型油菜。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种高通量、低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法，包括以下步骤：

S1.DNA提取：从油菜种子或者叶片中提取基因组DNA；