[发明专利]恒温条件检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法与试剂盒

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种于恒温条件下检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法与试剂盒。本发明提供一种引物组合，其包括用于特异性扩增KatG基因和InhA基因的内引物、外引物和环引物，以及分子信标探针。本发明还提供了相应的试剂盒和检测方法。本发明提供的检测方法可以在恒温条件下对待测样本进行结核分枝杆菌异烟肼耐药性的检测，具有检测速度快、灵敏度高、特异性强的优点。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种于恒温条件下检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法与试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)呈细长直或稍弯曲状，是引起人类结核感染的病原菌，其单一传染性病原体致死率高于艾滋病毒，是世界十大致死因素之一。据世界卫生组织2020年结核病报告显示，世界人口约有四分之一感染结核分枝杆菌。中国是全球结核病负担占比最高的三个国家之一，在结核病预防、筛查和治疗方面还需不断研究与创新。

异烟肼，又名4-吡啶甲酰肼、异烟酸肼，其对结核分枝杆菌有高度选择性、较强的抑制和杀灭作用，其生物膜穿透性好，由于疗效佳、毒性小、价廉、口服方便，故被列为首选抗结核药。由于异烟肼已有约五十年的使用历史，部分病人所感染的结核菌已经产生了耐药性。根据世卫组织的报告，2019年全球约有50万人患对利福平耐药的结核病，其中有78％的患者对利福平和异烟肼产生耐药。因此，对结核分枝杆菌异烟肼耐药性的检测非常必要。

目前，临床上常用表型药物敏感试验和PCR核酸检测法检测结核分枝杆菌的耐药性。其中，表型药物敏感试验必须使用培养后分离的菌株，一般需要 28～42天才能获得样品相关耐药性结果，操作繁琐且检测成本高，可能导致患者不能及时得到针对性的治疗，还增加了耐药结核病传播风险。而基于核酸检测的PCR荧光曲线技术具有较高的灵敏度和特异性，但存在假阳性率较高的缺点，样本中含有的抑制PCR反应的成分也会导致假阴性的出现。目前市场上用于结核病耐药检测的荧光PCR探针熔解曲线法，能够用于检测碱基插入、缺失、替代导致的基因突变，具有较高的灵敏度和特异性，但具有反应程序耗时长的缺陷。因此，本领域亟需更简洁、更灵敏的快速检测方法用于结核分枝杆菌异烟肼耐药的诊断。

近些年，在PCR基础上发展出了一种环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)，是由日本荣研株式会社的Notomi等人于2000 年开发出来的一种新型核酸扩增方法。它依赖于4条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列。这种链置换型的DNA聚合酶，使模板两端的引物结合处循环出现环状单链结构，保证引物顺利的与模板结合，进行链置换扩增反应。该技术更克服了需要反复热变性的PCR反应的特点，有效避免了升降温的过程当中耗时的缺点，实现了恒温条件下的连续快速扩增。

目前，本领域仍缺少有效的、同时针对多靶点的、利用环介导等温扩增技术来检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种于恒温条件下检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的方法与试剂盒，通过本发明提供的方法，在恒温条件下即可实现检测，无需变温扩增过程，而且具有检测速度快、灵敏度高、特异性强的优点。

相关研究表明，结核分枝杆菌耐异烟肼耐药与基因katG、inhA，ahpC的突变有关，其中，有54.9％的突变发生在katG基因第315位密码子上；有9.4％的突变发生在inhA启动子-17～-8区域及其1.2％的突变发生在inhA基因第94 位密码子，而inhA以启动子-15T突变最为常见；另外，有7.9％的突变发生在 ahpC基因启动子-46～4区域。但是，有研究表明，ahpC基因突变通常作为突变补偿伴随着katG基因第315位密码子突变出现。

根据本发明提供的检测方法，通过检测katG和inhA基因相关区域突变情况，从而得出异烟肼耐药性的信息。