[发明专利]一种快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法

权利要求书

1.一种快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）采集被检测海域的柱状沉积物样品，柱状沉积物采集时，以1-2 cm为一个采集深度，采集若干个不同深度的柱状沉积物，记为A1、A2、A3、A4…An；样品采集后低温保存；

（2）提取采集的不同深度柱状沉积物样品中的DNA；

（3）以不同深度柱状沉积物样品的DNA为模板，采用三疣梭子蟹COI基因的荧光定量引物对，进行荧光定量PCR扩增；根据扩增曲线获得不同样品DNA扩增后的Ct值；

（4）将获得的不同样品DNA扩增后的Ct值对照三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线，获得不同深度柱状沉积物样品DNA中COI基因的拷贝数；

（5）测定柱状沉积物A1、A2、A3、A4…An的同位素年代，并根据年代绘制不同深度柱状沉积物样品DNA中COI基因的拷贝数与年代的关系图，即得三疣梭子蟹资源量动态变化结果；

所述三疣梭子蟹COI基因的荧光定量引物对如下：

正向序列COI-qRTPCR for为：5’-GGGAGCAGTCTTTGGCATCT-3’；

反向序列COI-qRTPCR rev为：5’-GCCTCAGGTAGTATAAGCGTCT-3’；

所述步骤（4）中三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线由以下方法获得：

提取三疣梭子蟹基因组DNA作为模板，利用三疣梭子蟹COI基因的引物对进行扩增，检测扩增产物中COI基因的浓度并计算COI基因的拷贝数；根据扩增产物中COI基因的拷贝数将扩增产物稀释成不同拷贝数梯度的溶液作为模板，采用三疣梭子蟹COI基因的荧光定量引物对，进行荧光定量PCR扩增；根据扩增曲线获得不同拷贝数梯度的溶液扩增后的Ct值，以Ct值为横坐标，用已知起始拷贝数的对数为纵坐标，绘制三疣梭子蟹COI基因的标准曲线。

2.根据权利要求1所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，所述三疣梭子蟹COI基因的引物对如下：

正向序列COI for为：5’-TCGTGCTGAATTAGGACAACC-3’；

反向序列COI rev为：5’-AAGGAGAGAATATAACAGGCCGAC-3’。

3.根据权利要求2所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，以三疣梭子蟹基因组DNA为模板，采用三疣梭子蟹COI基因的引物对进行扩增时的PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性50 s，52 ℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃复延伸10 min；4℃保存并结束程序。

4.根据权利要求2所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，以三疣梭子蟹基因组DNA为模板，采用三疣梭子蟹COI基因的引物对进行扩增时的PCR反应体系为25 μL反应体系，具体包括：2×GC buffer I 12.5 μL，2.5mM dNTP Mixture 4 μL，5U/μLTaKaRa LA Taq 0.25 μL，模板DNA 1 μL，10mM上、下游引物各1 μL，无菌去离子水5.25 μL。

5.根据权利要求1所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，所述三疣梭子蟹COI基因的荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性30 s；95℃ 变性5 s，57℃退火30 s，72℃延伸32 s，40个循环。

6.根据权利要求1所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法，其特征在于，所述三疣梭子蟹COI基因的荧光定量PCR反应体系为20 μL反应体系，其中包括SYBR® PremixExTaq™ 10 μL，10 μM上、下游引物各0.4 μL，模板 2 μL，ROXII 0.4 μL，水6.8 μL。