[发明专利]一种检测恶性血液病IKZF家族基因突变的引物组合及方法

权利要求书

1.一种检测恶性血液病IKZF家族基因突变的引物组合，其特征在于，包括IKZF1-5基因外显子测序的71对引物，分为两个引物池，36对引物组成第一个引物池M1，35对引物组成第二个引物池M2。

2.根据权利要求1所述的一种检测恶性血液病IKZF家族基因突变的引物组合，其特征在于，所述M1引物池序列包括M1-1f～M1-36f和M1-1r～M1-36r，M2引物池序列包括M2-1f～M2-35f和M2-1r～M2-35r。

3.根据权利要求1所述的引物组合检测IKZF家族基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、恶性血液病患者单个核细胞的分离；

S2、细胞基因组DNA的提取；

S3、DNA文库构建，测序。

4.根据权利要求3所述的引物组合检测IKZF家族基因突变的方法，其特征在于，所述S3的操作步骤包括：

S3.1确认IKZF1-5基因外显子PCR扩增子序列；

S3.2准备并定量PCR扩增模板

S3.2.1将试剂盒置于室温；

S3.2.2配制工作液；

S3.2.3向分析管中加入配制的工作液190μL；

S3.2.4在分析管中分别加入dsDNA standard#1、standard#2和稀释的dsDNA样本，并标记；

S3.2.5室温避光孵育；

S3.2.6检测样本浓度；

S3.3基因特异性PCR

配制PCR扩增反应体系，混匀并置于PCR仪上运行

S3.4回收第一轮扩增产物

S3.4.1将磁珠置于室温中，充分轻柔混匀；

S3.4.2加入磁珠与反应液混合，轻柔吹吸混匀，室温孵育；

S3.4.3将EP管放置在磁力架上至液体澄清，吸弃上清；

S3.4.4将EP管保持在磁力架上，加入80％乙醇，室温放置30秒，弃上清；

S3.4.5重复上一步用80％乙醇洗一次；

S3.4.6将EP管保持在磁力架上干燥，观察磁珠表面不再反光即可；

S3.4.7将EP管从磁力架上取下，加入Nuclease-free水，轻柔吹打混匀，室温放置2min，再将EP管放置在磁力架上至液体澄清；

S3.4.8吸取上清至新PCR管，标记；

S3.5 Qubit 3.0对回收产物定量；

S3.6接头连接

配制第二轮PCR反应体系，合成PCR接头引物；

S3.7.混匀后离心，置于PCR仪上运行；

S3.8文库纯化

3.8.1将磁珠置于室温中，充分轻柔混匀；

3.8.2加入磁珠与反应液混合，轻柔吹吸混匀，室温孵育；

3.8.3将EP管放置在磁力架上至液体澄清，吸弃上清；

3.8.4将EP管保持在磁力架上，加入80％乙醇，室温放置30秒，弃上清；

3.8.5重复3.8.4步骤用80％乙醇洗一次；

3.8.6将EP管保持在磁力架上干燥，观察磁珠表面不再反光即可；

3.8.7将EP管从磁力架上取下，加入Nuclease-free水，轻柔吹打混匀，室温放置2min，再将EP管放置在磁力架上至液体澄清；

3.8.8吸取上清至新PCR管；

3.9Qubit定量产物浓度；

3.10送测序

获得的产物即是测序用的文库；不同样品之间等摩尔量混合后，即可进行Illumina测序。

5.根据权利要求4所述的引物组合检测IKZF家族基因突变的方法，其特征在于，所述S3.3中PCR扩增反应体系试剂包括Gene-specific PCR Master Mix1、PanelA/B、稀释的DNA模板和双蒸水。

6.根据权利要求5所述的引物组合检测IKZF家族基因突变的方法，其特征在于，所述PanelA/B的反应体系需分开配制。