[发明专利]一种检测恶性血液病IKZF家族基因突变的引物组合及方法

说明书

本发明公开一种检测恶性血液病IKZF家族基因突变的引物组合及方法，所述方法包含采用多重PCR建库、高通量测序技术对恶性血液病患者进行IKZF1‑5基因靶向外显子测序筛查。公开了包括71对引物序列及组合用于IKZF1‑5基因外显子检测。本发明具有检测范围全面、准确度及灵敏度高、特异性强的优点。检测所需患者的DNA量低，一次采血或骨髓穿刺即可满足需求，临床可操作性强，能快速、精准的检测恶性血液病患者的IKZF家族基因突变，应用于临床精准分型诊断、早期筛查高危亚型、预后评估和精准个体化靶向治疗指导。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种检测恶性血液病IKZF家族基因突变的引物组合及方法。

背景技术

IKZF家族由若干具有锌指结构的转录调控蛋白组成，其N末端锌指结构具有DNA结合功能，而C末端锌指结构用于IKZF家族成员之间的相互识别并结合形成同源或异源二聚体。IKZF家族成员主要包括Ikaros、Helios、Aiolos、Eos和Pegasus，分别由IKZF1-5基因编码。IKZF1和IKZF2在淋系细胞的增殖和分化调控中起重要作用。同时，研究表明IKZF1和IKZF2的异构体在白血病的发生和发展中具有重要作用。Ik-6是指IKZF13-6外显子缺失，是至今发现的在白血病发病机制中最重要的IKZF1异构体，是目前公认的一种高危预后标记。IKZF2是调节性T细胞的标志基因，在肿瘤微环境中起重要作用，其基因突变与肿瘤转移、治疗方案选择及预后有密切相关性。IKZF3编码的Aiolos蛋白，在淋巴细胞的分化发育中起着至关重要的作用。IKZF3突变在B细胞恶性肿瘤、慢性淋巴细胞白血病的发生发展中起关键作用。IKZF4和IKZF5也是重要的血细胞发育基因，在血液肿瘤细胞中表达量高。其基因突变不仅与肿瘤发生发展有关，还与血小板减少症的病理生理关系密切，提示其基因突变可指导患者预后分层及临床治疗选择。目前有研究报道，IKZF家族基因在急性白血病和骨髓增生异常综合征患者中突变比例较其他恶性血液病更高，且与患者预后相关，被认为是疾病的驱动因素。然而，目前只有IKZF1基因突变用于临床某些恶性血液病的检测和分型。因此，研发新方法全面检测IKZF家族5个成员在恶性血液病中的突变特征和分布，对其临床分型、预后判断及治疗方案选择等方面具有非常重要的意义。

传统的形态学结合流式免疫分型已不能满足精准医疗时代对恶性血液病患者诊断的需求。随着高通量测序技术的发展，发现了越来越多的与恶性血液病相关的分子学异常。携带这些分子学异常的患者往往临床治疗困难，易复发，预后差。早期识别新靶点进行精准个体化治疗成为今后治疗方向。但是，目前只有IKZF1突变检测包含在某些白血病高通量测序检测组套中，缺乏完整IKZF 家族5个成员基因突变的高通量检测方法。因此迫切需要开发针对IKZF家族基因突变更加全面、高效、简便的检测新方法，早期识别该家族基因分子学异常，有望为患者提供更精准的个体化治疗、改善预后和生存，有极大的临床价值和应用前景。

多重PCR技术可以在一个PCR反应体系里加入多对引物进行扩增，结合高通量测序技术，可用于待检测位点扩增后的测序。在一个PCR反应体系里加入多对待检测位点引物可以大大缩减工作量和试剂成本，同时又可满足临床希望全面、准确、快速地获取检测结果的需求，真正做到对恶性血液病患者进行精准、高效的高危亚型筛查。然而，在一个PCR反应体系里加入多对引物势必会增大引物二聚体形成的概率，导致检测效率的降低。因此，多重PCR引物及其组合的设计和优化是该技术的重点和难点，引物越多，设计难度越大。鉴于以上难点，本发明将针对IKZF1-5基因设计引物及其组合并优化，以适应临床检测特点和需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测恶性血液病IKZF家族基因突变的引物组合及方法，解决恶性血液病患者目前IKZF基因突变检测不能全面覆盖IKZF1-5 基因、检测困难、耗时、敏感性和精准性低等瓶颈技术问题，基于多重PCR结合高通量测序技术的引物组合和方法，用于检测恶性血液病患者IKZF1-5基因突变；方法中的引物及其组合经过多次优化，特异性、敏感性和精准性高；该技术应用于恶性血液病患者IKZF家族基因突变的检测，发挥指导临床精准分型诊断、早期筛查高危亚型、预后评估和个体化靶点治疗的重要作用。