[发明专利]一种基因重组串联表达利那洛肽的工程菌

说明书

本发明涉及了用于高表达利那洛肽的工程菌，通过特定数量的利那洛肽与重组标签串联获得融合蛋白，并用于利那洛肽的表达生产，极大地提高了利那洛肽的产率。

技术领域

本发明属于药物化学领域，涉及一种重组工程菌，具体涉及一种基因重组串联表达利那洛肽的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

利那洛肽(linaclotide)是Ironwood公司开发的治疗肠易激综合征(IBS-C)及成人慢性特发性便秘(CIC)的创新药物，全球年销售额在10亿美元以上，属于“重磅炸弹”药物，2019年在中国获批上市(产品名：令则舒)。该药物可以与肠道细胞表面的鸟苷酸环化酶C结合，促进胞内和胞外cGMP浓度增加，从而刺激肠液分泌，促进肠活动导致排便次数增多，同时兼具缓解内脏疼痛的作用。

原研和国内目前已报道的制备方法全都采用多肽固相合成，中国专利CN103626849A公开了一种合成方法，虽然其总收率据记载最高可达69.60％，但该方法在后期环化形成二硫键时需要分三步进行，操作非常复杂，产业化意义不大；中国专利CN104163853A、CN104231051A、CN102875655A、CN104844693A分别公开了利那洛肽的合成方法，总收率据记载最高为27％-43.5％，合成时需要使用昂贵的修饰氨基酸、树脂等原料，成本依然较高，而且生产过程需要使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、三氟乙酸(TFA)、二甲基亚砜(DMSO)、无水乙醚、乙腈等大量有机溶剂，生产成本和环保成本都很高。为了克服现有技术的不足，本案设计了一种基于生物法的制备工艺，即采用基因重组串联表达生产，过程只需要葡萄糖和几种无机盐以及少量乙腈，大大降低了生产成本，且生产过程绿色环保。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种生产成本低、生产过程绿色环保的串联表达利那洛肽的基因工程菌，以及其制备方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种基因重组串联表达利那洛肽的融合蛋白，其特征在于，

由TrxA融合标签和利那洛肽串联表达制备；

其中，所述TrxA融合标签包含来自SEQ ID NO:1所述核苷酸序列：

SEQ ID NO:1：

atggcagacaaaatcatccacctgaccgacgactctttcgacaccgacgttctgaaagcggacggtgcgatcctggttgacttctgggcggaatggtgcggtccgtgcaaaatgatcgcgccgatcctggacgaaatcgcggacgaataccagggtaaactgaccgttgcgaaactgaacatcgaccagaacccgggtaccgcgccgaaatacggtatccgtggtatcccgaccctgctgctgttcaaaaacggtgaagttgcggcgaccaaagttggtgcgctgtctaaaggtcagctgaaagaattcctggacgcgaacctggcgggttctggtcatcatcatcatcatcat

进一步地，所述TrxA融合标签包含来自SEQ ID NO:2所述氨基酸序列：

SEQ ID NO:2：

MADKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGHHHHHH

其中，利那洛肽包含来自SEQ ID NO:3所述核苷酸序列：

SEQ ID NO:3：