[发明专利]一种血清蛋白制备方法及血清蛋白质组质谱检测方法

权利要求书

1.一种血清蛋白制备方法，包括如下步骤：

（1）将血清样品低温低速离心，弃去沉淀，保留上清液；

（2）向步骤（1）所得上清液中加入稀释缓冲液；

（3）向步骤（2）所得的样品溶液中加入表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒，孵育反应，磁性分离收集磁性纳米颗粒；

（4）向步骤（3）所得磁性纳米颗粒中加入消化缓冲液，反应；

（5）向步骤（4）所得体系中加入胰蛋白酶，酶解得到血清蛋白质组样品；

步骤（3）中，所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒为表面葡聚糖/聚苯乙烯修饰的磁性纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述低温低速离心的温度为2~8℃；离心力为500~2000 RCF；离心时间为10~20分钟；

步骤（2）中，所述稀释缓冲液为PBS缓冲液，所述稀释缓冲液与上清液等体积混合。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒的粒径为50~200nm；

所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒中，亲水性颗粒与疏水性颗粒的质量比为10~5:1；

所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒的用量为10~50µg/µl所述血清样品。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表面亲水与疏水性改性的混合磁性纳米颗粒根据下述方法进行制备：

高温热分解法制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒，

b）制备 Fe₃O₄@SiO₂ 磁性纳米颗粒，

c）制备甲基丙烯酰胺葡萄糖单体，

d）制备表面葡聚糖/聚苯乙烯修饰的磁性纳米颗粒，即表面亲水与疏水性改性的混合磁性纳米颗粒。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述孵育反应的条件为：25~37℃下孵育反应5~10分钟。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述消化缓冲液包含能破坏二硫键的还原剂以及烷基化巯基的烷基化试剂；

所述消化缓冲液含有n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷，还原试剂及烷基化试剂；

其中，所述还原试剂为二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或β巯基乙醇；

所述烷基化试剂为碘乙酰胺或氯乙酰胺；

所述消化缓冲液的加入量20-50ul /25µl所述血清样品；

所述反应的温度为45~95℃，时间为10-60分钟。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，待步骤（4）所得体系冷却至室温后向其中加入胰蛋白酶；

所述胰蛋白酶的加入量为10~100ng/µl所述血清样品；

所述酶解的条件为：温度为25~37℃，时间为6~16小时。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在酶解后还进一步包括对酶解后体系脱盐的操作，步骤如下：向步骤（5）所得体系中加入20%的三氟乙酸，离心，吸取上清，低温冷冻干燥，脱盐，即得血清蛋白质组样品；

其中，三氟乙酸的加入量使得体系中三氟乙酸的终浓度为1%。

9.一种血清蛋白质组样品的质谱检测方法，包括如下步骤：

按照权利要求1-8中任一项所述方法制备血清蛋白质组样品；

采用多肽反相色谱进行分离，采用高场非对称波形离子迁移谱进行质谱鉴定；

其中，使用Thermo Fisher的Easy1200液相串联Orbitrap Exploris 480质谱进行数据非依赖型采集。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

液相条件为：使用柱长25 cm的C₁₈反相色谱柱；

流动相A为0.1% 甲酸水溶液，流动相B为0.1% 甲酸 80% 乙腈溶液，流速为600nl/min；

洗脱梯度如下：0-8min，7-12% B；8-60min，12-30% B；60-65min，65-84% B；84-85min，42-95% B and 85-90min，95% B；

质谱鉴定为数据非依赖型采集模式，扫描方式为正离子扫描模式，一级质谱采用Orbitrap检测，分辨率12,000/30,000@ m/z 200，最大注入时间为 20 ms，扫描范围为 m/z200~2000，最大离子注入时间为Auto，目标AGC设为1 000%，归一化碎裂能量为 32%，FAIMS补偿电压设置为-45V 或者-65V 或者-45V-65V；每次采集的 DIA 隔离窗口为2-3Th，隔离窗口数目为 40-60，每次覆盖120 Th的m/z范围，分别进行CV-45V和CV-65V的GPF-DIA数据采集，归一化碎裂能量为32％。