[发明专利]一种血清蛋白制备方法及血清蛋白质组质谱检测方法

说明书

本发明公开了一种血清蛋白制备方法及血清蛋白质组质谱检测方法。本发明针对目前血清蛋白质组样品制备方法的局限性，建立了基于表面亲水与疏水性材料混合的磁性纳米材料，利用纳米颗粒‑蛋白在溶液中接触所形成在的“蛋白冠”，实现了对血清蛋白的非浓度依赖性富集，结合高场非对称波形离子迁移谱（FAIMS）与优化建立的数据非依赖型质谱扫描模式，实现了对血清蛋白质组的深度覆盖与精准定量检测。

技术领域

本发明涉及一种血清蛋白制备方法及血清蛋白质组质谱检测方法，属于蛋白质组分析领域。

背景技术

血清样品是来源稳定，生物信息丰富的重要临床样本。而蛋白质是生命活动或生物功能的直接执行者，因此血清样品中的大分子蛋白质的丰度变化，可以间接灵敏的反映生物体内脏器的疾病状态，目前血清样品是临床上首选的生物标志物来源之一。然而血清样品也是分析难度最高的样品，血清中的白蛋白含量约占血清全部蛋白总质量的50%，血清中丰度最高的22种蛋白丰度占所有血清蛋白丰度总和的99%，目前预测血清中的蛋白种类超过1万种，浓度动态范围超过10个数量级，传统的基于质谱的血清蛋白质组研究中，质谱会反复检测这些高丰度蛋白，导致可能成为潜在生物标志物的低丰度蛋白很难被检测到。目前通用的血清蛋白质组检测策略是采用亲和富集的方法去除血清中的白蛋白、IgG等高丰度蛋白，或通过质谱检测前的色谱多级分馏模式，来降低血清蛋白样品的复杂度，提高中低丰度血清蛋白的质谱检测效率。但高丰度蛋白在血清中是一类重要的载体，血清中非常多的蛋白都会与高丰度蛋白结合来实现转运或者发挥生物功能。因此血清高丰度蛋白去除的同时，很多与其结合的中低丰度蛋白也会被同时损失掉，影响血清中蛋白定量结果的真实性与准确性。利用色谱多级分流可以降低血清样品复杂度，降低血清样品的动态范围，但也会显著增加质谱检测的扫描时间，更重要的是多级分流导致样品变异度增加，定量准确性降低，无法应用于规模化、高通量的临床蛋白质组分析。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种血清蛋白制备方法。

本发明所提供的血清蛋白制备方法，包括如下步骤：

（1）将血清样品低温低速离心，弃去沉淀，保留上清液；

（2）向步骤（1）所得上清液中加入稀释缓冲液；

（3）向步骤（2）所得的样品溶液中加入表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒，孵育反应，磁性分离收集磁性纳米颗粒；

（4）向步骤（3）所得磁性纳米颗粒中加入消化缓冲液，反应；

（5）向步骤（4）所得体系中加入胰蛋白酶，酶解得到血清蛋白质组样品。

上述方法步骤（1）中，所述低温低速离心的温度可为2~8℃，优选4℃；离心力可为500~2000 RCF，优选1000 RCF或1500 RCF；离心时间可为10~20分钟，优选15或10分钟；

步骤（2）中，所述稀释缓冲液可为PBS缓冲液，所述稀释缓冲液与上清液等体积混合；

步骤（3）中，所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒为表面葡聚糖/聚苯乙烯修饰的磁性纳米颗粒；

所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒的粒径可为50~200nm；

所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒中，亲水性颗粒与疏水性颗粒的质量比可为10~5:1，优选10:1；

所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒的用量为10~50µg/µl所述血清样品；

所述表面亲水与疏水性改性的混合磁性纳米颗粒可根据现有方法进行制备，也可根据下述方法进行制备：

a）高温热分解法制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒，步骤如下：