[发明专利]结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法

权利要求书

1.一种结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法，其特征在于，包括：

步骤S1，将预处理后的猪眼葡萄膜制备脱细胞基质胶；

步骤S2，维持培养hiPSCs；

步骤S3，培养hiPSC-RPE悬浮球；

步骤S4，hiPSC-RPE细胞扩增培养；

步骤S5,生成hiPSC-RPE细胞膜片；

其中，所述步骤S5中，将浓度为1％的Uvea-Gel包被培养皿，于37℃放置30min左右，待Uvea-Gel凝固，形成一层薄薄的膜样区域为BM膜，用以模拟天然BM微环境。

2.根据权利要求1所述的结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法，其特征在于，所述步骤S1中，预处理后的猪眼葡萄膜经两轮浸泡后冷冻干燥形成脱细胞基质粉末，脱细胞基质粉末用胃蛋白酶酶解后，与0.1N氢氧化钠溶液中和形成脱细胞基质胶。

3.根据权利要求2所述的结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法，其特征在于，第一轮浸泡依次采用5％Triton X-100浸泡4h，5％SDS浸泡4h，4M尿素浸泡4h，用去离子水浸泡1.5h，第二轮浸泡依次采用1％Triton X-100浸泡3h，PBS洗15min，1％Triton X-100浸泡18h。

4.根据权利要求3所述的结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法，其特征在于，在所述步骤S2中，将hiPSCs接种于脱细胞基质胶包被的培养板，于mTeSR1(Stem Cell)培养基中维持培养4-5天，选取克隆密度长至约80％-90％底面积时进行传代。

5.根据权利要求1所述的结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法，其特征在于，在所述步骤S3中，将维持培养后的hiPSCs采用0.5mM的EDTA消化为小细胞团，向小细胞团内加入含有10μM的Blebbistatin的培养液，并将其转移至低吸附皿中，于37℃培养过夜，24h后可见EBs形成，将形成的EBs连续保持悬浮培养6天后诱导分化，其中，EBs培养第一天培养液替换为25％NIM和75％mTeSR1，EBs培养第二天培养液替换为50％NIM和50％mTeSR1，EBs培养第三天，将EBs转移到到含有NIM培养液培养3天，EBs培养第6-7天，将EBs重新接种在用脱细胞基质胶包被的培养皿中，开始贴壁培养诱导分化，诱导分化25天，富集形成RPE球。

6.根据权利要求5所述的结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法，其特征在于，所述诱导分化后形成的3D视网膜诱导分化的视杯样结构为典型六边形结构，且色素化。

7.根据权利要求5所述的结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法，其特征在于，在所述步骤S4中，将富集的RPE球悬浮培养8周后分成若干小块，将小块RPE球于37℃条件下，用dispase II孵育5-10min，解离成单细胞悬液，将单细胞悬液接种在0.1％的Uvea-Gel包被的培养板中进行扩增。

8.根据权利要求7所述的结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法，其特征在于，所述单细胞悬液扩增初期选用血清培养基，后期选用无血清培养基促进hiPSC-RPE分化成熟。

9.根据权利要求1所述的结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法，其特征在于，在所述步骤S5中，单细胞hiPSC-RPE接种至BM膜上，进行增殖和分化，hiPSC-RPE细胞生长4-6周后可形成含色素并且紧密连接的RPE片。

10.根据权利要求9所述的结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法，其特征在于，将形成的Uvea-Gel/hiPSC-RPE细胞膜片分割为任意大小，通过dispase II孵育3-5min后，将hiPSC-RPE细胞膜片脱离基质胶层，形成hiPSC-RPE细胞膜片。