[发明专利]结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法

说明书

本发明涉及一种结合生物基质胶生成hiPSC‑RPE细胞膜片的方法，包括，步骤S1，将预处理后的猪眼葡萄膜制备脱细胞基质胶；步骤S2，维持培养hiPSCs；步骤S3，培养hiPSC‑RPE悬浮球；步骤S4，hiPSC‑RPE细胞扩增培养；步骤S5,生成hiPSC‑RPE细胞膜片；其中，所述步骤S5中，将浓度为1％的Uvea‑Gel包被培养皿，于37℃放置30min左右，待Uvea‑Gel凝固，形成一层薄薄的膜样区域为BM膜，用以模拟天然BM微环境。本发明优化出从猪脉络膜组织分离制备脱细胞基质水凝胶，结合建立的hiPSC诱导3D视网膜分化系统，获得hiPSC‑RPE细胞，建立模拟Bruch膜(BM)微环境的生成RPE片的方法，为培养GMP级别干细胞提供安全有效的生物材料。

技术领域

本发明涉及hiPSC-RPE细胞膜片领域，尤其涉及一种结合生物基质胶生成 hiPSC-RPE细胞膜片的方法。

背景技术

在室温条件下，基质胶Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质，模 拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分 化，可用于对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达等的研究。目前基质 胶均从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出基底膜基质，其主要成分有层 粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋 白酶等。

现有RPE sheets的制备主要依据合成材料，其与天然的BM膜的环境有很多 差异，尚无用hiPSC来源RPE证明在Uvea-Gel上的安全性和有效性。因此，设 计一种水凝胶代替目前临床中使用的羊膜，更真实的模拟BM微环境，借助hiPSCs 向3D视网膜分化体系，开发成GMP级别的hiPSC-RPE片，促进临床转化和应用 是现阶段工作重点。

发明内容

为此，本发明提供一种结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片的方法，优 化出从猪脉络膜组织分离制备脱细胞基质水凝胶，结合建立的hiPSC诱导3D视 网膜分化系统，获得hiPSC-RPE细胞，建立模拟Bruch膜(BM)微环境的生成 RPE片的方法，为培养GMP级别干细胞提供安全有效的生物材料。

为实现上述目的，本发明提供一种结合生物基质胶生成hiPSC-RPE细胞膜片 的方法，包括：

步骤S1，将预处理后的猪眼葡萄膜制备脱细胞基质胶；

步骤S2，维持培养hiPSCs；

步骤S3，培养hiPSC-RPE悬浮球；

步骤S4，hiPSC-RPE细胞扩增培养；

步骤S5,生成hiPSC-RPE细胞膜片；

其中，所述步骤S5中，将浓度为1％的Uvea-Gel包被培养皿，于37℃放置 30min左右，待Uvea-Gel凝固，形成一层薄薄的膜样区域为BM膜，用以模拟天 然BM微环境。

进一步地，所述步骤S1中，预处理后的猪眼葡萄膜经两轮浸泡后冷冻干燥 形成脱细胞基质粉末，脱细胞基质粉末用胃蛋白酶酶解后，与0.1N氢氧化钠溶 液中和形成脱细胞基质胶。

进一步地，第一轮浸泡依次采用5％Triton X-100浸泡4h，5％SDS浸泡4h， 4M尿素浸泡4h，用去离子水浸泡1.5h，第二轮浸泡依次采用1％Triton X-100 浸泡3h，PBS洗15min，1％Triton X-100浸泡18h。

进一步地，在所述步骤S2中，将hiPSCs接种于脱细胞基质胶包被的培养板， 于mTeSR1(Stem Cell)培养基中维持培养4-5天，选取克隆密度长至约80％-90％ 底面积时进行传代。