[发明专利]一种易栓症基因突变的多重PCR检测方法和试剂盒

说明书

本发明涉及一种易栓症基因突变的多重PCR检测方法和检测盒，方法包括以下步骤：获取待检测基因第一轮扩增产物；使用接头引物对获得的扩增产物进行第二轮扩增，对获得的文库进行测序；对获得的测序结果进行分析，实现全编码区的突变检测。本发明对待检测样品的起始量要求低，可对血浆和血清中的极低DNA样品进行分析；可实现全编码区基因突变检测，能发现新的基因突变；检测灵敏度高，检测时间短，结合高通量测序技术，可短时间内实现全编码区突变检测。

技术领域

本发明属于基因突变检测领域，具体涉及一种易栓症基因突变的多重PCR检测方法和试剂盒。

背景技术

血栓是全球前三位致死性心血管疾病--心脏病、脑卒中和静脉血栓栓塞症的共同发病机制。前两者的严重程度已经被广泛了解，但是静脉血栓认知仍然很低。在美国，每年有10～30万人死于静脉血栓，相关住院人数超过50万。在欧洲，每年有50万人死于静脉血栓，超过艾滋病、乳腺癌和前列腺癌、高速公路交通事故死亡人数之和。一般来说易栓症是指由于遗传性或获得性原因导致机体容易发生血栓的一种病理生理过程，其不同于高凝状态和血检前状态，是指患者存在易发生血栓的缺陷,血管壁损伤、血流滞缓、血液高凝是易栓症形成的三大要素，这种缺陷可以是遗传的，也可继发于某种疾病呈获得性。临床上以以静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism，VTE)为多见，如下肢深静脉血栓(deep venousthrombosis，DVT)、肺栓，也有少数为动脉血栓栓塞。如蛋白C、蛋白S编码基因缺陷患者由于某种基因异常引起血液凝固性增高，若患者合并其他血栓诱发因素，如口服避孕药、妊娠分娩或手术等时，就可能导致VTE。

传统的遗传性易栓症诊断主要依赖表型检测，当表型检测结果异常时，再针对相关基因进行以一代测序技术为基础的基因检测，寻找是否存在致病突变。

发明人发现相关技术至少存在以下技术问题：

表型诊断有诸多局限性，如只能检测血浆中的蛋白成分，当患者处于血栓急性期或口服抗凝药物期间会影响检测结果的准确性，且表型检测由于方法学上的局限性，很难反映被检蛋白的全部情况，且有些VTE发生相关的蛋白尚无有意义的表型检测方法，如血栓调节蛋白、内皮细胞PC受体、肝素辅因子Ⅱ等。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种易栓症基因突变的多重PCR检测方法和检测盒。该方法和检测盒能够解决表型检测由于方法学上的局限性，很难反映被检蛋白的全部情况的技术问题。

一种易栓症基因突变的多重PCR检测方法，所述方法包括以下步骤：

步骤一、获取待检测基因第一轮扩增产物；

步骤二、使用接头引物对步骤一获得的扩增产物进行第二轮扩增，其中，所述接头引物的上游引物SEQ ID NO.3的碱基序列为：

“AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGAGCTCAAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT”；

下游引物SEQ ID NO.4的碱基序列为：

“CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATGCGAGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA”；

步骤三、对步骤二获得的文库进行测序；

步骤四、对步骤三获得的测序结果进行分析，实现全编码区的突变检测。

在一种可选的实施例中，步骤一包括使用609对引物对所述待检测基因进行扩增，所述609对引物为具有SEQ ID No 5-SEQ ID No 1327所示序列或其同源序列。

在一种可选的实施例中，所述609对引物包括第一套引物对与第二套引物对；