[发明专利]DPH6基因在制备具有毒素抗性细胞系中的应用

说明书

本发明公开了DPH6基因在制备具有毒素抗性细胞系中的应用。本发明的研究证明敲除DPH6基因可导致细胞对DT产生耐受性，因此通过基因工程手段抑制细胞中DPH6基因表达可制备具有毒素抗性的细胞系。本发明的具有毒素抗性细胞系可用于制备抗体偶联药物，生产效率高且获得的产品稳定，在临床使用时可极大降低用药副作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及DPH6基因在制备具有毒素抗性的细胞系中的应用。

背景技术

白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)是由棒状白喉杆菌分泌的一种毒素。DT毒素有553个氨基酸。白喉酰胺是蛋白质翻译延伸因子EF2蛋白组氨酸残基上一个特殊的修饰。它广泛存在于古细菌和真核生物，包括人类。白喉毒素正是通过识别白喉酰胺对EF2进一步修饰，从而使蛋白质合成停止，细胞死亡。

绿脓杆菌外毒素，又称为假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A，PE)的单个多肽链是由3个区域组成，其中区域三(氨基酸405-613)主要是毒素催化区，负责抑制蛋白的合成和诱导细胞死亡，机制同白喉毒素。

抗体偶联药物(antibody drug conjugates，ADCs)是单克隆抗体与抗肿瘤毒性小分子的偶联产物。抗肿瘤毒性小分子可通过抑制DNA、RNA、蛋白合成、细胞分裂等对肿瘤细胞进行杀伤。抗体毒素偶联物的生产系统包括原核细胞系统和真核细胞系统，真核细胞系统又包括酵母系统、昆虫系统和哺乳动物系统。抗体毒素偶联物制备的前提是生产系统需要对表达的毒素具有抗性才能保证抗体毒素偶联物的大量产出。本申请的研究目的就在于提供一种具有毒素抗性的细胞株以生产稳定共价键连接的抗体毒素偶联物。

发明内容

本发明的目的在于通过基因工程的手段，对现有蛋白生产细胞株进行改造，使其对偶联药物毒性耐受，并直接生产蛋白药物偶联物，使其由稳定共价键连接，避免蛋白药物偶联物的不稳定性产生的副作用。

为了达到上述目的，本发明提供具体方案如下：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备具有毒素抗性细胞系或提高细胞系的毒素耐受性的方法，所述方法包括抑制DPH6基因表达。

进一步，所述毒素是ADP-核糖基化毒素。

进一步，所述毒素包括但不限于DT、PE、皂草素、明胶肽、全溶素、李斯特菌素、α-溶血素、枯草杆菌酶细胞毒素、布干维尔素或蓖麻毒素。

优选地，所述毒素是白喉毒素或PE。

进一步，细胞系包含来自哺乳动物细胞系，优选人或小鼠细胞系的细胞。哺乳动物细胞系可以是癌细胞，如A431，A549，HCT116，K562，Hela；可以是正常的非癌细胞，如HEK-293，CHO；优选地，HEK-293细胞是freestyle 293F细胞。

进一步，抑制DPH6基因表达的方法包括基因敲除技术、反义核苷酸技术、RNAi技术。

可用于本发明的基因敲除技术包括CRISPR技术、锌指酶ZFN技术、TALEN技术。

优选地，基因敲除技术使用的是CRISPR技术；

更优选地，CRISPR技术使用的是CRISPR/Cas系统；

在本发明的具体实施方案中，CRISPR/Cas系统是CRISPR/Cas9系统。

RNAi技术抑制基因表达使用的试剂包括如下：双链RNA，短发夹RNA(shRNA)或微小RNA(shRNAmir)。

具体地，所述方法包括如下步骤：

1)将靶向DPH6基因或其转录物的核酸分子导入所选细胞中；

2)培养经步骤1)处理的细胞。