[发明专利]一种提高根瘤菌固氮效率的人工串联多肽ADPs、表达载体和重组根瘤菌构建及应用

说明书

本发明提供了一种提高根瘤菌固氮效率的人工串联多肽ADPs、表达载体和重组根瘤菌构建及应用，涉及根瘤固氮技术领域。本发明将若干个等电点相近的NCR多肽进行串联；并将所述人工串联多肽ADPs的编码基因插入pHC60形成表达载体，再转化Mesorhizobium japonicum MAFF303099，得到重组根瘤菌，使人工串联多肽ADPs在根瘤菌中表达。将所述重组根瘤菌接种到百脉根上后，可显著改变类菌体形态并提高固氮酶活性。

技术领域

本发明属于根瘤固氮技术领域，具体涉及一种提高根瘤菌固氮效率的人工串联多肽ADPs、表达载体和重组根瘤菌构建及应用。

背景技术

在豆科植物与根瘤菌的共生过程中，豆科植物的根部会形成一种特殊的器官——根瘤。根据根瘤的形态和结构，可以将其分为定型根瘤和不定型根瘤两种类型，这两种类型的根瘤早期发育过程基本一致，但在后期不定型根瘤中存在类菌体的末端分化。

类菌体的末端分化主要是指根瘤菌侵染植物后的一种不可逆转的分化状态，根瘤菌发生形态上的变化，如细胞伸长以及基因组扩增，膜的通透性的改变还有繁殖能力的丧失等。并且在IRLC豆科植物的不定型根瘤中存在一种根瘤特异的富含半胱氨酸(nodule-specific cysteine-rich，NCR)多肽，这种NCR多肽可能与根瘤中类菌体的末端分化有关。

NCR多肽是一类具有生物学活性的小分子多肽，一般由20-50个氨基酸残基组成，结构复杂多样。NCR多肽主要由两部分组成：一部分是N端的信号肽；另一部分是含有4个或6个保守半胱氨酸的成熟活性肽。NCR多肽含有的氨基酸种类和数量具有较大差异，这导致NCR多肽的一些重要的理化性质，比如等电点，也存在较大的差异，进而影响NCR多肽的功能。在生物体内，NCR多肽主要通过靶向类菌体的细胞周期蛋白和一些细胞通路的关键因子来行使功能。并且，NCR多肽往往不是单独发挥作用的，通常由几个NCR多肽组合在一起来行使功能。

NCR多肽主要在IRLC豆科植物的不定型根瘤中表达。根据已有的报道可知，通过对蒺藜苜蓿的根瘤进行转录组分析，截至目前已经发现了700多种NCR多肽。不同的NCR多肽在豆科植物与根瘤菌共生过程中的不同阶段起作用，它们对豆科植物与根瘤菌的共生至关重要。但是如何应用已知的NCR多肽，目前只有极少的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高根瘤菌固氮效率的人工串联多肽ADPs、表达载体和重组根瘤菌构建及应用，显著提高根瘤菌的固氮效率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种提高根瘤菌固氮效率的人工串联多肽ADPs，所述人工串联多肽ADPs包括若干个依次连接的NCR多肽；

所述NCR多肽的等电点为4.23～8.25。

优选的，所述人工串联多肽ADPs包括由3～4个NCR多肽依次利用linker连接后形成的多肽。

优选的，所述人工串联多肽ADPs的结构包括：第一NCR-linker-第二NCR-linker-第三NCR-linker-第四NCR；

所述第一NCR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二NCR的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，所述第三NCR的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第四NCR的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述第一NCR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述第二NCR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述第三NCR的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述第四NCR的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种包含上述人工串联多肽ADPs的编码基因的表达载体，所述表达载体的基础载体包括pHC60。