[发明专利]一种用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法

权利要求书

1.一种用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，包括：

步骤一，称取酒醅样品，放入灭菌离心管中；并向灭菌离心管中加入酚抽提取液和蛋白酶抑制剂，终浓度为1mM；

步骤二，冰上超声破碎，超声结束后，用玻棒将上层漂浮的谷壳去除，同过程重复1次；谷壳去除完成后，对溶液进行离心；离心完成后，用移液器吸取中层溶液，转移至新的离心管中；同法重复1次，将两次转移的溶液混合；

步骤三，在步骤二中两次转移得到的溶液混合中加入等体积的酚-Tris-HCl饱和溶液，并进行混均；对混合溶液进行离心，收集酚上层；再加入预冷0.1M醋酸铵-甲醇溶液，过夜沉淀，离心，收集沉淀；

步骤四，加入预冷甲醇进行清洗，轻微混合；并进行离心，收集沉淀，重复一次；以丙酮代替甲醇重复上述过程两遍，充分去除甲醇；去除甲醇完成后，收集沉淀；在常温下进行干燥，溶解于样品裂解液中，室温溶解一定时间；

步骤五，将溶液在室温下进行离心，取上清，并再次离心取上清；上清即为样品的总蛋白溶液，进行蛋白浓度测定并分装后储存于一定温度下备用。

2.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤一中，称取酒醅样品质量为1g。

3.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤一中，灭菌离心管中加入酚抽提取液和蛋白酶抑制剂，使其终浓度为1mM，具体过程为：

称取1g酒醅样品，放入灭菌离心管中；加入2mL酚抽提取液[蔗糖0.70mol/L、NaCl0.01mol/L、EDTA-2Na 0.04mol/L、二硫苏糖醇0.01mol/L、Tris-HCl(pH6.8)0.13mol/L、Tris-HCl(pH8.8)0.38mol/L]，加入蛋白酶抑制剂(苯甲基磺酰氟)使其终浓度为1mM。

4.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤二中，冰上超声破碎过程具体为：冰上超声破碎，功率80W，超声1.0s,关闭1.0s,共3min。

5.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤二中，谷壳去除完成后，对溶液进行离心具体过程为：4℃，2000rpm离心20min。

6.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤三中，加入等体积的酚-Tris-HCl饱和溶液，并进行混均，具体过程为：加入等体积的酚-Tris-HCl饱和溶液(pH 7.8)，4℃混合30min，期间多次摇晃混匀。

7.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤三中，对混合溶液进行离，心收集酚上层，具体过程为：4℃，8000rpm离心10min，收集酚上层。

8.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤三中，加入预冷0.1M醋酸铵-甲醇溶液，过夜沉淀，离心，收集沉淀，具体过程为：加入5倍体积的预冷0.1M醋酸铵-甲醇溶液，-20℃过夜沉淀；4℃，12000rpm离心10min，收集沉淀。

9.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤四，具体过程为：加入5倍体积的预冷甲醇进行清洗，轻微混合；4℃，12000rpm离心10min，收集沉淀，重复一次；

以丙酮代替甲醇重复上述过程两遍，充分去除甲醇；4℃，12000rpm离心10min，收集沉淀；常温下干燥5min，溶解于样品裂解液中，室温溶解3h。

10.如权利要求1所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤五，具体过程为：将溶液在室温下12000rpm离心10min，取上清，并再次离心取上清；上清即为样品的总蛋白溶液，进行蛋白浓度测定并分装后储存于-80℃备用。