[发明专利]一种用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法

说明书

本发明属于白酒酒醅技术领域，公开了一种用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，称取酒醅样品，并加入酚抽提取液和蛋白酶抑制剂；冰上超声破碎；用玻棒去除谷壳；对溶液进行离心，用移液器吸取中层溶液，转移至新的离心管中；在两次转移得到的溶液混合中加入等体积的酚‑Tris‑HCl饱和溶液进行离心，收集酚上层；加入预冷0.1M醋酸铵‑甲醇溶液，沉淀离心；加入预冷甲醇清洗，并离心，收集沉淀；以丙酮代替甲醇去除甲醇，收集沉淀；溶解于样品裂解液中，将溶液进行离心，取上清，并再次离心取上清。本发明显著提高酒醅微生物蛋白质定性鉴定结果的可靠性和鉴定物种的多样性，为深入揭示酒醅微生物的多样性及生理功能奠定基础。

技术领域

本发明属于白酒酒醅技术领域，尤其涉及一种用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法。

背景技术

中国白酒的酿造依赖酒醅(发酵中的粮谷)微生物的协同发酵。揭示酒醅微生物群落演替对白酒香味物质形成的影响是酿酒领域的研究热点和重点。但现阶段针对酒醅微生物的研究主要集中于宏基因组层面，宏蛋白组学研究进展相对缓慢。蛋白质是基因功能的最终执行者，宏蛋白组学的研究结果是对环境微生物群落活动的直接表征。酒醅微生物宏蛋白组学研究的匮乏阻碍对白酒发酵机理的深入认识。

微生物宏蛋白组学旨在从蛋白质水平揭示环境样品微生物的多样性及其生理功能。得益于质谱技术的快速发展，微生物宏蛋白组学被广泛应用于海洋、肠道和土壤等生态环境的研究中。然而由于环境样品的理化性质复杂多样，目前尚未形成统一的蛋白质提取方法。普遍情况下，环境样品须经液氮研磨预处理使其蛋白充分释放后才能获得较好的提取效果。但不同与普通的环境样品，白酒酒醅是由高粱、小麦和稻米等粮谷发酵形成的产物，其中混杂大量的粮谷蛋白，其含量也远高于微生物蛋白。因此，现阶段采用液氮研磨预处理，其中，预处理具体过程为：向1g酒醅样品中加入液氮，充分研磨。将样品粉末取出适量，转移至2mL离心管中。加入1mL酚抽提取液，加入蛋白酶抑制剂(苯甲基磺酰氟)使其终浓度为1mM。冰上超声破碎，功率80W，超声1.0s，关闭1.0s，共3min。但是采用液氮研磨进行预处理，会造成粮谷蛋白和微生物蛋白混在一起。在随后进行蛋白肽段的搜库鉴定时，使本属于粮谷的蛋白被鉴定为微生物蛋白，造成假阳性结果，严重影响酒醅微生物宏蛋白组学结果的准确性。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术采用液氮研磨进行预处理，会造成粮谷蛋白和微生物蛋白混在一起；在随后进行蛋白肽段的搜库鉴定时，使本属于粮谷的蛋白被鉴定为微生物蛋白，造成假阳性结果，严重影响酒醅微生物宏蛋白组学结果的准确性。

解决以上问题及缺陷的难度为：对于如水稻、拟南芥这些单一物种，提取它们的蛋白质后能很明确的断定这些蛋白质就是来自于这个物种，只需选择它们的蛋白质数据库进行鉴定即可。但是宏蛋白组学提取的是环境样品中所有微生物的蛋白，最大的难点是如何确定获得的蛋白质来自于哪种微生物，因为相同的蛋白质也可能是不同的微生物分泌而来。这时选择蛋白质鉴定的数据库非常重要。例如当获得一个蛋白质NB时，若是选择了物种A或B的蛋白质数据库，就意味默认了NB是来自于A或B物种。同样道理，研磨处理酒醅会使粮谷蛋白和微生物蛋白混在一起，后续选择微生物蛋白质数据库鉴定时，就导致粮谷蛋白被鉴定成了微生物蛋白，提高了错误率。所以，提取酒醅微生物蛋白质的提前是如何使酒醅中的粮谷和微生物菌体得到有效分离，确保提取的蛋白质尽可能来自微生物。但是由于酒醅具有黏度，微生物菌体附着在粮谷上。所以，本发明首先采用超声波震荡将微生物菌体从粮谷中剥离出来，再采用离心法进行分离，随后提取蛋白质。而在液氮研磨方法中，第一步液氮研磨已经把粮谷和微生物蛋白质混在一起，再采用超声震荡也无法将两者的蛋白质有效分离。解决以上问题及缺陷的意义为：提高酒醅微生物蛋白质鉴定结果的准确性。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法。

本发明是这样实现的，一种用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，所述用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法，包括：