[发明专利]大肠杆菌基因编辑系统及其基因编辑方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌(Escherichia coli)基因编辑系统，其特征在于，包含：

一大肠杆菌；

一辅助质粒，包含依序排列之一转座酶复合物表达盒、一Cas12k表达盒、一第一sgRNA盒、一第一抗生素抗性基因和一第一复制起始点，其中转座酶复合物表达盒包含一第一启动子、一tnsB基因、一tnsC基因和一tniQ基因，该Cas12k表达盒包含一第二启动子和一Cas12k基因，该第一sgRNA盒包含一第三启动子和一sgRNA序列，该sgRNA序列由一骨架和一间隔(spacer)所构成；以及

一供体质粒，包含依序排列之一ShCAST转座子左端序列、一外源基因表达盒、一ShCAST转座子右端序列、一第二sgRNA盒、一第二抗生素抗性基因和一第二复制起始点，其中该外源基因表达盒包含一外源基因，该第二sgRNA盒包含一第四启动子和该sgRNA序列；

其中该间隔之序列与该大肠杆菌之一染色体之一第一特定序列相对应，且该第一抗生素抗性基因和该第二抗生素抗性基因不相同。

2.如权利要求1所述之大肠杆菌基因编辑系统，其特征在于，该第二启动子为lac启动子、Tet启动子、T7启动子、Tac启动子或J23118启动子。

3.如权利要求1所述之大肠杆菌基因编辑系统，其特征在于，该转座酶复合物表达盒更包含一终止子，且该终止子连接于该tniQ基因之3’端。

4.如权利要求1所述之大肠杆菌基因编辑系统，其特征在于，该外源基因表达盒更包含一第五启动子和一第三抗生素抗性基因，且该第三抗生素抗性基因与该第一抗生素抗性基因和该第二抗生素抗性基因不相同。

5.如权利要求4所述之大肠杆菌基因编辑系统，其特征在于，该供体质粒更包含一CRISPRi模块，该CRISPRi模块位于该ShCAST转座子左端序列和该外源基因表达盒之间。

6.如权利要求1所述之大肠杆菌基因编辑系统，其特征在于，该大肠杆菌为BL21(DE3)菌株、BW25113菌株、MG1655菌株、W3110菌株、W菌株或DH10Bac菌株。

7.一种大肠杆菌(Escherichia coli)基因编辑方法，其特征在于，包含：

构建一辅助质粒，其中该辅助质粒包含依序排列之一转座酶复合物表达盒、一Cas12k表达盒、一第一sgRNA盒、一第一抗生素抗性基因和一第一复制起始点，其中该转座酶复合物表达盒包含一第一启动子、一tnsB基因、一tnsC基因和一tniQ基因，该Cas12k表达盒包含一第二启动子和一Cas12k基因，该第一sgRNA盒包含一第三启动子和一sgRNA序列，该sgRNA序列由一骨架和一间隔(spacer)所构成；

构建一供体质粒，其中该供体质粒包含依序排列之一ShCAST转座子左端序列、一外源基因表达盒、一ShCAST转座子右端序列、一第二sgRNA盒、一第二抗生素抗性基因和一第二复制起始点，其中该外源基因表达盒包含一外源基因，该第二sgRNA盒包含一第四启动子和该sgRNA序列，且该第一抗生素抗性基因和该第二抗生素抗性基因不相同；

将该辅助质粒和该供体质粒共同转化至一大肠杆菌中，以得到一转化株；以及

培养该转化株，系于一编辑温度下培养一编辑时间，其中该辅助质粒表达之一TnsB蛋白、一TnsC蛋白、一TniQ蛋白和一Cas12k蛋白形成一ShCAST转座子蛋白酶复合物，且该辅助质粒表达该sgRNA序列，该供体质粒表达该sgRNA序列，将该外源基因嵌入该转化株之第一特定序列中。

8.如权利要求7所述之大肠杆菌基因编辑方法，其特征在于，该大肠杆菌为BL21(DE3)菌株、BW25113菌株、MG1655菌株、W3110菌株、W菌株或DH10Bac菌株。

9.如权利要求7所述之大肠杆菌基因编辑方法，其特征在于，该编辑温度为30℃。