[发明专利]大肠杆菌基因编辑系统及其基因编辑方法

说明书

本发明提供一种大肠杆菌基因编辑系统，包含大肠杆菌、辅助质粒和供体质粒。其中辅助质粒包含转座酶复合物表达盒、Cas12k表达盒、第一sgRNA盒、第一抗生素抗性基因和第一复制起始点，供体质粒包含ShCAST转座子左端序列、外源基因表达盒、ShCAST转座子右端序列、第二sgRNA盒、第二抗生素抗性基因和一第二复制起始点。所述大肠杆菌基因编辑系统可以简便且有效的嵌入大片段的DNA序列至目标染色体中，且不会造成大肠杆菌基因组的双链断裂，以调节不同生物技术中有用的大肠杆菌菌株代谢途径。

【技术领域】

本发明是有关于一种微生物的基因编辑技术，特别是一种大肠杆菌基因编辑系统及其基因编辑方法。

【先前技术】

大肠杆菌是工业上用于生产重组蛋白和生质(biomass)化学品的最广泛使用的细菌。有许多不同的大肠杆菌菌株用于各种目的。例如，BL21(DE3)菌株常用于重组蛋白生产；MG1655、W3110和W菌株用于生产生质化学品；DH10Bac菌株含有结合杆状病毒基因组和质粒特征的杆粒(Bacmid)，在Bac-to-Bac^TM系统中被用于杆粒的改造，基改杆粒可用来生产重组杆状病毒，重组杆状病毒常用于生产重组蛋白或是当作基因递送的载体。

为了提高大肠杆菌的生产性能，通常需要嵌入多种代谢途径基因至目标染色体，来永久操纵代谢途径。然而将大片段基因嵌入到大肠杆菌中仍然是一项具有挑战性的任务。尽管使用λ-Red系统的基因重组可以轻松地将基因嵌入到大肠杆菌中，但嵌入片段大小极有限。自从CRISPR/Cas9技术问世以来，CRISPR/Cas9与λ-Red结合以进一步提高嵌入DNA大小，成功嵌入大于10kb的DNA片段到大肠杆菌基因组中。尽管CRISPR/Cas9结合λ-Red系统可在MG1655菌株中进行基因工程与代谢工程，但在其他重要大肠杆菌菌株如BL21(DE3)和W中的基因嵌入效率相对较低，可能是因为前述系统诱导DNA双链断裂(double-strandbreaks,DSBs)，并利用内在的DNA修复机制，将欲嵌入的DNA嵌入到基因组中。然而不同菌株的DNA修复能力差异很大，因此导致其他大肠杆菌菌株的嵌入效率较低。

CRISPR相关转座酶(ShCAST)是一种新兴的靶向基因组敲入和敲除的强大工具，其无关于宿主细胞修复机制，结合了转座酶的高效DNA嵌入和CRISPR介导的可编程无DNA双链断裂的基因嵌入，但ShCAST技术在染色体特定位置仍有嵌入不佳的问题。因此，如何改善上述应用于大肠杆菌的基因编辑系统的缺失，为目前所欲解决的重要课题之一。

【发明内容】

有鉴于此，本发明提供一种大肠杆菌基因编辑系统及其基因编辑方法，所述大肠杆菌基因编辑系统透过增强Cas12k基因表达、修改复制起始点的序列以及增加sgRNA表达量，只需表达四种蛋白，由两个质粒协作即可进行多位点基因嵌入，并嵌入大片段DNA至目标染色体中。并可进一步降低基因编辑时的温度，以提升基因编辑效率。

本发明之一态样是在提供一种大肠杆菌(Escherichia coli)基因编辑系统，其包含大肠杆菌、辅助质粒和供体质粒。辅助质粒包含依序排列之转座酶复合物表达盒、Cas12k表达盒、第一sgRNA盒、第一抗生素抗性基因和第一复制起始点。其中转座酶复合物表达盒包含第一启动子、tnsB基因、tnsC基因和tniQ基因，Cas12k表达盒包含第二启动子和Cas12k基因，第一sgRNA盒包含第三启动子和sgRNA序列。所述sgRNA序列由骨架和间隔(spacer)所构成。供体质粒包含依序排列之ShCAST转座子左端序列、外源基因表达盒、ShCAST转座子右端序列、第二sgRNA盒、第二抗生素抗性基因和第二复制起始点。外源基因表达盒包含外源基因，第二sgRNA盒包含一第四启动子和sgRNA序列。其中间隔之序列与大肠杆菌之染色体之第一特定序列相对应，且第一抗生素抗性基因和第二抗生素抗性基因不相同。

依据前述之大肠杆菌基因编辑系统，其中所述第二启动子可为lac启动子、Tet启动子、T7启动子、Tac启动子或J23118启动子。