[发明专利]一种次磺酸化蛋白质特异性标记分子及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种次磺酸化蛋白质特异性标记分子及其制备方法与应用。本发明次磺酸化蛋白质特异性标记分子为式Ⅰ所示化合物，式Ⅰ所示化合物具有与次磺酸化快速反应的双环[6,1,0]壬炔(BCN)衍生物和便于抗体富集的标签二甲基哌啶。抗标签固定化抗体树脂可以特异性识别式Ⅰ所示化合物中的二甲基哌啶(Kd＝86pM)，并且可以在酸性或中性条件下以温和的方式释放目标蛋白/肽段。式Ⅰ所示化合物和抗标签固定化抗体树脂可实现次磺酸化蛋白质的特异性富集。本发明进一步建立了鉴定生物样本包括尿液外泌体中次磺酸化蛋白的质谱分析方法，实现对次磺酸化肽段的高选择性富集检测。

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，涉及一种次磺酸化蛋白质特异性标记分子及其制备方法与应用。

背景技术

蛋白质次磺酸化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，它们通常是半胱氨酸的巯基与活性氧化物(ROS)或活性氮化物(RNS)反应生成的早期氧化产物。蛋白质中半胱氨酸次磺酸化修饰是巯基的可逆氧化状态，半衰期约为半分钟，它会进一步被氧化成更加的稳定的亚磺酸、磺酸或者与其它巯基生成二硫化物。由于次磺酸化学基团的化学性质活泼，使得半胱氨酸次磺酸化在蛋白质的氧化还原调节中发挥着关键作用。越来越多的证据表明半胱氨酸次磺酸化可调节蛋白质活性、稳定性、蛋白质与蛋白质的相互作用，并且在信号传导、癌症的发病机制等发挥作用。

在复杂生物体中检测蛋白质中半胱氨酸次磺酸化修饰这种存在时间短暂的氧化中间体具有挑战性。对于半胱氨酸次磺酸化的研究大多都基于其与环己二酮的衍生物的特异性反应作为基础进行检测，杨靖等人利用此方法从细胞中鉴定出700多种蛋白质包括1000多个次磺酸化蛋白位点。然而环己二酮类探针有自身的局限性，主要是其反应速度慢，从而导致遗漏部分次磺酸化蛋位点的鉴定，限制了对次磺酸化蛋白生物作用的深入研究。同时为了提高体内低丰度次磺酸化蛋白的检测灵敏度，大都采用先富集后检测的策略，其中因生物素与链霉亲和素的强相互作用，在富集方法中最为常用。然而众所周知生物素与链霉亲和素的结合力太强无法用温和的方式释放。此外，为了防止富集假阳性的出现还需要考虑对内源性生物素的去除。

发明内容

本发明的目的是提供一种次磺酸化蛋白质特异性标记分子及其制备方法与应用，该次磺酸化蛋白质特异性标记分子为式Ⅰ所示化合物，式Ⅰ所示化合物具有与次磺酸化快速反应的双环[6,1,0]壬炔(BCN)衍生物和便于抗体富集的标签二甲基哌啶，抗标签固定化抗体可以特异性识别二甲基哌啶(Kd＝86pM)，并且可以在酸性或中性条件下以温和的方式释放目标蛋白/肽段。

第一方面，本发明保护式Ⅰ所示化合物，

式Ⅰ所示化合物的化学名称为双环[6,1,0]壬-4-炔-9-基-2,6-二甲基哌啶；化学式为C₂₆ H₄₃ N₃O₂。

第二方面，本发明保护式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)溴乙酸-叔丁酯与2,6-二甲基-哌啶在三氟乙酸中经取代反应，得到(2,6-二甲基-哌啶-1-基)-乙酸-叔丁酯；(2,6-二甲基-哌啶-1-基)-乙酸-叔丁酯在酸性条件下脱保护，得到(2,6-二甲基-哌啶-1-基)-乙酸盐酸盐；

(2)将(2,6-二甲基-哌啶-1-基)-乙酸盐酸盐和碳二亚胺类缩合剂加入至有机溶剂中，冰浴搅拌，然后再依次加入催化剂和双环[6,1,0]壬炔，搅拌后再加入缚酸剂，经酰胺反应，得到式Ⅰ所示化合物。

进一步地，步骤(1)中，所述溴乙酸-叔丁酯和所述2,6-二甲基-哌啶的投料摩尔比为1:2～1:4，具体可为1:2.3；

所述2,6-二甲基-哌啶和所述三氟乙酸的体积比为1：5；所述取代反应的温度可为回流温度，时间可为5～8h(如5h)；