[发明专利]一种犹素探针UFM1-Lys-TAMRA及其合成方法

说明书

本发明属于蛋白质合成技术领域，具体涉及一种犹素探针UFM1‑Lys‑TAMRA及其合成方法，该制备方法包括以下步骤，利用犹素激活酶活化犹素C端后原位肼解，制备犹素酰肼；将所述犹素酰肼经原位氧化转化为犹素硫酯；将所述犹素硫酯直接氨解，获得所述犹素探针UFM1‑Lys‑TAMRA。本发明首先运用犹素激活酶UBA5催化的原位活化策略制备犹素酰肼UFM1‑NHNHsubgt;2/subgt;，并基于酰肼法将其进一步转化为犹素硫酯UFM1‑Mesna，进而通过直接氨解法获得犹素探针UFM1‑Lys‑TAMRA。具有制备产率高、合成纯度高、操作简易、可大量制备、合成成本低等特点。

技术领域

本发明属于蛋白质合成技术领域，具体涉及一种犹素探针UFM1-Lys-TAMRA及其合成方法。

背景技术

犹素(UFM1)是一种类泛素修饰因子，它可以通过一系列特异性的酶促级联共价连接到底物蛋白上，从而形成动态可逆的翻译后修饰，该过程被称为犹素化(Ufmylation)。犹素化参与了很多重要的生理过程，如内质网稳态、囊泡运输、转录调控、DNA损伤应答等，而该过程的异常也与多种人类疾病有关，如癌症、糖尿病、精神分裂症、缺血性心脏病等。蛋白质犹素修饰是一个动态可逆的过程，结合在底物上的犹素可以被去犹素化酶(UfSPs)特异性去除。去犹素化酶是蛋白质犹素化调控信号中的关键因子，也被认为是具有潜力的药物靶标。因此，研究去犹素化酶的酶活性质以及筛选去犹素化酶的特异性小分子抑制剂对于理解犹素调控功能和机制以及疾病诊断和治疗都具有重要意义。

基于活性的荧光探针是检测去犹素化酶活性以及高通量筛选去犹素化酶抑制剂的重要工具。

发明内容

本发明旨在提供一种犹素探针UFM1-Lys-TAMRA的合成方法，具有产率高、纯度高、操作简易、可大量制备的特点。

按照本发明的技术方案，所述犹素探针UFM1-Lys-TAMRA的合成方法，包括以下步骤，

S1：利用犹素激活酶(UBA5)活化犹素C端后原位肼解，制备犹素酰肼；

S2：将所述犹素酰肼经原位氧化转化为犹素硫酯；

S2：将所述犹素硫酯直接氨解，获得所述犹素探针UFM1-Lys-TAMRA。

本发明设计了一种新型的犹素荧光探针UFM1-Lys-TAMRA，它可以应用于监测去犹素化酶的活性以及用于去犹素化酶抑制剂高通量筛选等，其原理在于：去犹素化酶可以特异性识别UFM1-Lys-TAMRA末端的异肽键，并将其水解释放出荧光基团Lys-TAMRA。当被偏振光激发时，UFM1-Lys-TAMRA主要发射偏振光，而游离的Lys-TAMRA则主要发射去偏振光，通过监测荧光偏振的变化便可以检测去犹素化酶活性。它相较于目前已报道的犹素荧光探针UFM1-AMC的优点在于其检测的是荧光偏振的变化，在筛选小分子抑制剂时不会受到抑制剂本身荧光的干扰，并且UFM1与荧光基团Lys-TAMRA上的赖氨酸侧链氨基以异肽键相连，能更好的模拟生理条件下的犹素修饰。

具体的，所述犹素的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，可以通过重组菌表达得到，所述重组菌为转染目的基因(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)的大肠杆菌BL21(DE3)，步骤如下：

1a、挑取UFM1单克隆菌落至16mL含有氨苄抗性的LB培养基中，37℃、200rpm下培养14h；

1b、取1a中培养的菌液加入至含有氨苄抗性的1L LB培养基中，37℃、200rpm继续培养，待菌液OD 600吸光值达到0.6-0.8时，加入800μL 1.0M的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)对菌液进行诱导，16℃、180rpm继续培养18h；