[发明专利]一种磷酸化肽的相对定量方法

权利要求书

1.一种磷酸化肽的相对定量方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对待测生物样品进行前处理，得到多肽样品；

（2）向多肽样品中加入轻或重同位素标记试剂进行标记，所述轻同位素标记试剂为二甲胺盐酸盐(CH₃)₂NH·HCl，所述重同位素标记试剂为氘代二甲胺盐酸盐(CD₃)₂NH·HCl；二甲胺或氘代二甲胺与多肽中的衍生位点羧基发生反应生成酰胺键的同时使其带上标记，在二甲胺标记之后，多肽中的羧基被中性化，使得非磷酸化肽的负电性基团消失，仅磷酸化肽存在显著负电性；

（3）将质量比例确定的轻、重同位素标记的多肽衍生产物用含0.1v/v%三氟乙酸的80v/v%乙腈稀释后，随后混合，然后用TiO₂磁性纳米颗粒特异性富集混合多肽样品中磷酸化肽；

（4）通过液相色谱-质谱联用检测步骤（3）所得经TiO₂富集后样品，以提取离子色谱峰的峰面积数值为依据，比较序列相同的磷酸化肽在两组样品间的相对量差异。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品为组织、体液、蛋白质样品，所述前处理步骤包括酶解、脱盐、干燥步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）：将干燥的多肽被溶于0.5-1.0mol/L二甲胺盐酸盐或氘代二甲胺盐酸盐与0.5mol/L N-甲基吗啡啉的混合溶液中，再加入30-50mmol/L六氟磷酸(7-氮杂苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷，其中溶剂为二甲基亚砜，常温且黑暗处放置0.6-1.2h完成标记。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）：将质量比例确定的轻、重同位素标记的多肽衍生产物用含0.1v/v%三氟乙酸的80v/v%乙腈稀释后，随后混合，再将混合液加入到2-8 mg/mL TiO₂磁性颗粒悬浮液中震荡1-2h；用含0.1v/v%三氟乙酸的30v/v% 丙酮和含0.1v/v%三氟乙酸的50v/v% 乙腈分别清洗磁珠；用含5wt% NH₄OH 的20v/v% 乙腈洗脱样品，回收洗脱液并真空干燥。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）：液相色谱包括下列条件：

流动相A：乙腈/甲酸/水=20/1/980，v/v/v；流动相B：乙腈/甲酸/水=980/1/20，v/v/v；流动相的梯度洗脱程序如下：0min，5%B；2min，5%B；30 min，38%B；38 min，90%B；43 min，90%B；45 min，5%B；60min，5%B；色谱柱为C18，3.0μm，0.3 mm × 150 mm。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）：当待测生物样品中蛋白质的质量不超过200μg时，加入轻或重标记试剂的用量为0.02–0.04mmol；当生物样品中蛋白质的质量超过200μg时，所述轻或重标记试剂的用量等比例增加。

7.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）：加入TiO₂磁性纳米颗粒的质量为待富集多肽等同于原始蛋白质质量的2-6倍。

8.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（3）顺序调换，多肽被标记后还需经过二次脱盐，才可以通过液相色谱-质谱完成检测。