[发明专利]一种磷酸化肽的相对定量方法

说明书

本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种磷酸化肽的相对定量方法。本方法使用二甲胺、氘代二甲胺作为标记试剂，可标记多肽中的C端以及天冬氨酸R基团、谷氨酸R基团，二甲胺或氘代二甲胺与多肽中的衍生位点——羧基发生反应，在生成酰胺键的同时使其带上标记。将轻重标记的样品混合，经TiO₂富集后，通过液相色谱‑质谱联用检测，以提取离子色谱峰的峰面积数值为依据，即可分析同一条多肽在两组样品间的相对量差异。该标记定量方法不仅不干扰磷酸化肽的检测，还可增强TiO₂对磷酸化肽的富集特异性。

技术领域

本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种磷酸化肽的相对定量方法。

背景技术

作为生命活动的主要执行者，蛋白质经常呈现多样化的翻译后修饰，尤以磷酸化修饰最为普遍。通过激酶“写入”磷酸基和磷酸酶“擦除”磷酸基，可改变蛋白质的三维结构以实现其活性的调控。生物体内的蛋白质磷酸化过程是短暂且处于动态变化中的，通过定量分析掌握这些变化，将有助于洞悉生命活动中信号传导及功能的实现机制。由此，蛋白质磷酸化的相关研究已由早期的定性分析逐步发展到定量分析。

蛋白质翻译后修饰的定量分析一般是基于“自下而上”(bottom-up)的质谱方法，大体可分为3类：无标记定量技术(label free)、代谢标记技术(metabolic labeling)、化学标记技术(chemical labeling)。

无标记定量技术不使用任何标签，通过比较质谱峰强度以分析不同来源样品中同一蛋白质的相对丰度差异。以SILAC(stable isotope labelling by amino acids incellculture)为代表的代谢标记技术一般是在细胞培养阶段用轻重型同位素标记的氨基酸分别培养细胞，经数代后将标记的蛋白质混合处理。在比较氨基酸序列相同且拥有不同同位素标记的多肽的相对丰度后，得到各种蛋白质在不同处理过程中的表达量差异。化学标记是一种将蛋白质或多肽提取后再标记其特定氨基酸的技术，主要分为2类：轻重同位素标记法、同整质量标签标记法。常见的轻重同位素标记试剂有ICAT(isotope-coded affinitytag)、甲醛等。ICAT用于标记半胱氨酸，甲醛则标记多肽N端与赖氨酸。将轻重型同位素标记的样品混合处理，通过质谱分析比较不同样品中同一蛋白质的相对丰度差异。以iTRAQ(isobaric tagsfor relative and absolute quantitation)、TMT(tandem mass tag)技术为代表的同整质量标签标记，是使用一组拥有同整质量的试剂分别标记不同的样品，将样品混合后可在二级质谱谱图中观察各报告基团的相对丰度，进而比较不同样品中同一蛋白质的表达量差异。

虽然上述三类方法均可用于磷酸化肽的相对定量分析，然而，各方法都存在一些缺陷，并不非常适合此类多肽。例如，磷酸化肽具有质谱电离强度低、易丢失磷酸基团等特点，导致采用无标记定量技术时误差较大，难以得到有统计学意义的定量信息；SILAC主要适用于体外培养细胞，而对生物模型的标记成本太高，也难以应对组织、体液等样品；ICAT技术只能标记半胱氨酸，而磷酸化肽经常不含此氨基酸；单个甲醛标记位点可在轻重标记间产生4Da的差异，此差异偏小，可能存在因衍生位点过少而导致轻重标记多肽的同位素峰重叠等问题；同整质量标签试剂的优势在于可同时标记多个样品，但价格昂贵。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于建立一种具有广谱性且操作简单、价格低廉的磷酸化肽的相对定量方法。该方法使用二甲胺、氘代二甲胺作为标记试剂，可标记多肽中的C端以及天冬氨酸R基团、谷氨酸R基团，属于化学标记技术中的“轻重同位素标记法”。二甲胺或氘代二甲胺与多肽中的衍生位点——羧基发生反应，在生成酰胺键的同时使其带上标记。将轻重标记的样品混合，通过质谱检测即可分析同一条多肽在两组样品间的相对量差异。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种磷酸化肽的相对定量方法，包括以下步骤：