[发明专利]一种多聚磷酸激酶突变体、工程菌及其应用

权利要求书

1.一种多聚磷酸激酶突变体，其特征在于，所述多聚磷酸激酶突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第79位、第106位、第108位、第111位或第285位进行单突变或多突变获得的。

2.如权利要求1所述的多聚磷酸激酶突变体，其特征在于，所述多聚磷酸激酶突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第79位丙氨酸突变变为甘氨酸；(2)第106位丝氨酸突变为半胱氨酸；(3)第108位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、天冬酰胺或酪氨酸；(4)第111位丝氨酸突变为谷氨酸或赖氨酸或丙氨酸；(5)第285位亮氨酸突变为脯氨酸；(6)第79位丙氨酸突变为甘氨酸、第108位异亮氨酸突变为苯丙氨酸；(7)第79位丙氨酸突变为甘氨酸、第106位丝氨酸突变为半胱氨酸、第108位异亮氨酸突变为苯丙氨酸；(8)第79位丙氨酸突变为甘氨酸、第106位丝氨酸突变为半胱氨酸、第108位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第111位丝氨酸突变为丙氨酸；(9)第79位丙氨酸突变为甘氨酸、第106位丝氨酸突变为半胱氨酸、第108位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第285位亮氨酸突变为脯氨酸。

3.一种权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体的编码基因。

4.一种包含权利要求3所述编码基因的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体在构建ATP再生体系中的应用。

6.一种权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体在合成烟酰胺单核苷酸中的应用，其特征在于，所述应用的方法为：将所述多聚磷酸激酶突变体基因工程菌和烟酰胺核糖激酶基因工程菌分别经诱导培养获得的湿菌体用缓冲液重悬并采用超声破碎，以破碎后的上清液为催化剂，以腺嘌呤核苷三磷酸和烟酰胺核糖为底物，加入氯化镁和聚磷酸，以pH6.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃进行反应，反应液分离纯化，获得烟酰胺单核苷酸。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述腺嘌呤核苷三磷酸加入量以缓冲液体积计为10-100mM；所述烟酰胺核糖加入量以缓冲液体积计为50-200mM；所述氯化镁加入量以缓冲液体积计为5-20mM；所述聚磷酸加入量以缓冲液体积计为1-10g/L；所述多聚磷酸激酶突变体加入量以破碎前湿菌体量计为2-30mg/mL缓冲液；所述烟酰胺核糖激酶加入量以破碎前湿菌体量计为5-30mg/mL缓冲液。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述催化剂按如下方法制备：将多聚磷酸激酶突变体基因工程菌接种至含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体沉淀；收集的湿菌体用pH为7.5的50mM磷酸钾缓冲液重悬，并使用超声波细胞粉碎机破碎，破碎功率为50W，每工作1s，间歇2s，总共破碎20min；收集细胞裂解液，在12000g下离心1min，取上清液，即为粗酶液；所述烟酰胺核糖激酶基因工程菌的上清液制备方法同多聚磷酸激酶突变体基因工程菌。

9.一种权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体在合成葡萄糖6磷酸中的应用，其特征在于所述应用的方法为：将所述多聚磷酸激酶突变体基因工程菌和己糖激酶基因工程菌分别经诱导培养获得的湿菌体用缓冲液重悬并采用超声破碎，取破碎后的上清液为催化剂，以腺嘌呤核苷三磷酸和葡萄糖为底物，加入氯化镁和聚磷酸，以pH 7.2的缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃进行反应，反应液分离纯化，获得葡萄糖6磷酸。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述腺嘌呤核苷三磷酸加入量以缓冲液体积计为10-100mM；所述葡萄糖加入量以缓冲液体积计为20-150mM；所述氯化镁加入量以缓冲液体积计为5-20mM；所述聚磷酸加入量以缓冲液体积计为1-10g/L；所述多聚磷酸激酶突变体入量以破碎前湿菌体量计为2-30mg/mL缓冲液；所述己糖激酶加入量以破碎前湿菌体量计为5-30mg/mL缓冲液。