[发明专利]一种多聚磷酸激酶突变体、工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种多聚磷酸激酶突变体、工程菌及其应用，所述多聚磷酸激酶突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第79位、第106位、第108位、第111位或第285位进行单突变或多突变获得的。本发明提供了多种来源于Cytophaga hutchinsonii的多聚磷酸激酶突变体，这些突变体的比酶活较母本多聚磷酸激酶提升2.7‑17.9倍，这些突变体构成的ATP再生体系能减少70％以上ATP依赖的生物催化合成反应中ATP的消耗，具有广泛的工业应用前景。

(一)技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种多聚磷酸激酶(PPK)突变体、工程菌及其应用，开发高效廉价的ATP再生体系。

(二)背景技术

腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)是生物体中调节能量代谢、RNA和DNA合成以及信号转导等多种生物过程的关键分子。大量潜在的生物催化剂的活性，包括连接酶、激酶和合成酶，也依赖ATP。在这些生物转化过程中导入ATP再生系统可以显著降低ATP的消耗。大多数ATP再生系统包括磷酸供体以及催化ADP和磷酸供体之间的磷酸转移酶。然而很多有价值的产品的生物合成需要由AMP直接生成ATP的再生系统，如土四环素、1,6-六甲二胺和β-卡碱酰胺等。为了从AMP再生ATP，可以采用将AMP合成ADP的再生系统导入到从ADP开始生成ATP的再生系统。

值得注意的是，多种酶和磷酸供体的使用会使原本的生物转化过程更加复杂。考虑到这些限制，人们对聚磷酸激酶2-III类(PPK2-III)酶进行了深入研究，因为它们可以将AMP转化为ATP。磷酸供体的可及性和稳定性对ATP再生系统应用至关重要。对于PPK2-III酶构成的ATP再生系统，无机聚磷酸盐(polyP)是一种稳定的磷酸供体。在很多研究中，长链polyP被作为磷酸供体。但是，使用短链polyP作为磷酸供体可以使ATP生成系统更具吸引力，因为短链polyP比长链polyP更廉价。最容易获得的polyP是的聚磷酸(PPA)，它是含有不同长度线性多聚磷酸的混合物，大量用于颜料、石油催化剂、香料和阻火剂的制造。在此，我们旨在开发一种基于PPK2-III酶并能以AMP和PPA为底物的的高效廉价ATP再生系统。我们对来自Cytophaga hutchinsonii的多聚磷酸酶(ChPPK)进行了分子改造，以提高其酶学性质，用于构建廉价高效的ATP再生体系。

(三)发明内容

本发明目的是针对现有多聚磷酸激酶活性不高的问题，提供一种多聚磷酸激酶突变体及利用该多聚磷酸激酶突变体基因重组菌或其粗酶液作为生物催化剂，用于ATP再生系统的构建，以解决现有ATP再生系统效率较低的问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种多聚磷酸激酶突变体，所述多聚磷酸激酶突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第79位、第106位、第108位、第111位或第285位进行单突变或多突变获得的；所述SEQ ID NO：2所示氨基酸序列编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，所述多聚磷酸激酶突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第79位丙氨酸突变为甘氨酸(A79G)；(2)第106位丝氨酸突变为半胱氨酸(S106C)；(3)第108位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、天冬酰胺或酪氨酸(I108F、I108N、I108Y)；(4)第111位丝氨酸突变为谷氨酸或赖氨酸或丙氨酸(S111E、S111K、S111A)；(5)第285位亮氨酸突变为脯氨酸(L285P)；(6)第79位丙氨酸突变为甘氨酸、第108位异亮氨酸突变为苯丙氨酸(A79G/I108F)；(7)第79位丙氨酸突变为甘氨酸、第106位丝氨酸突变为半胱氨酸、第108位异亮氨酸突变为苯丙氨酸(A79G/S106C/I108F)；(8)第79位丙氨酸突变为甘氨酸、第106位丝氨酸突变为半胱氨酸、第108位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第111位丝氨酸突变为丙氨酸(A79G/S106C/I108F/S111A)；(9)第79位丙氨酸突变为甘氨酸、第106位丝氨酸突变为半胱氨酸、第108位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第285位亮氨酸突变为脯氨酸(A79G/S106C/I108F/L285P)。