[发明专利]用于修复Klhl18lowf

说明书

本发明公开了一种用于修复Klhl18^lowf突变基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用，该系统包括特异性靶向Klhl18^lowf的sgRNA、同源修复供体模板以及Cas9，并通过腺相关病毒载体递送，形成有效修复突变基因的编辑系统。本发明通过纯合Klhl18^lowf小鼠模型实验，评价其对听力功能的影响，结果发现该系统能对患病小鼠进行精准的体内同源介导修复，成功纠正点突变，且小鼠注射该系统后长达24周内，可观察到听觉功能恢复、纤毛形态变规则、IHC持续囊泡释放功能恢复等，直观地验证了本发明系统对Klhl18^lowf导致的感音神经性聋的治疗作用，能够用于制备治疗感音神经性聋的药物。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域、医药领域，具体涉及一种用于修复Klhl18^lowf基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用。

背景技术

尽管研究发现超过100个基因和超过6000个基因位点与非综合征型或综合征型耳聋相关，但临床上对于遗传性耳聋的治疗除了佩戴助听器和植入人工耳蜗，尚无其它有效治疗的药物。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)已被应用于多项临床实验，并已经获得批准应用于临床，对人体细胞生长、形态或分化无明显病理影响，具有安全性高、免疫原性弱、宿主范围广、物理性质稳定、表达时间长及稳定等优点。多项研究表明AAV是目前感音神经性耳聋基因治疗的首选载体。针对隐性遗传性耳聋的基因治疗，传统的方法是以AAV为载体导入外源基因，促进靶蛋白在特定细胞亚群中的正常表达，以辅助听觉功能的恢复。然而，AAV介导的过表达策略可能需要多次给药以维持治疗效果，诱发临床相关免疫反应，而且外源性基因异位过表达可能会引起潜在的风险。

在非综合征型遗传性耳聋中，80％是常染色体隐性遗传性耳聋，其最佳的治疗方法是对基因突变位点进行精准地纠正，进而长久地恢复听力。Kelch-like18(Klhl18)基因位于9号染色体，编码574个氨基酸的蛋白质，其突变后主要引起隐性遗传性耳聋。Klhl18^lowf小鼠是指Klhl18发生p.V55F错义点突变(Chr9:110455454CA)，纯合子表现为第4周开始出现以低频为主的渐进性听力下降，随着年龄增长，听力下降逐渐累及其它频率，最后发展为全频型严重耳聋，而杂合子听力正常。Klhl18^lowf小鼠的渐进性听力表型为基因治疗提供了干预的窗口。

CRISPR/Cas9系统是近年来兴起的新型基因编辑工具，基于其操作简单、高效性的特点，其已经在疾病的治疗中显示出了巨大的应用潜力。CRISPR/Cas9系统主要由两部分组成，分别为sgRNA和Cas9，二者形成复合体，sgRNA与靶位点DNA通过碱基互补实现定位，同时识别旁边PAM序列，然后Cas9核酸酶切割DNA，导致DNA发生断裂。细胞内主要有两种DNA损伤修复机制：非同源末端连接(Non-homologous end-joining，NHEJ)和同源重组修复(Homologous recombination，HR)。NHEJ修复后，在断裂处会引入碱基的插入或缺失，因此常用于基因的敲除；当有外源性DNA同源模板存在时，利用HR可以实现序列的精确变换或者定点插入。CRISPR/Cas9介导的HR已被成功用于有效纠正C57BL/6NTac受精卵中的Cdh23ahl等位基因并挽救了相关的听觉表型。然而，尚无关于在出生后阶段(即体内)利用HR在体进行耳聋基因治疗的临床前研究。通过体内提高CRISPR/Cas9介导的精确基因编辑或HR介导的基因敲入的效率，以精准纠正致病突变基因实现听力保护，仍然是一个重大挑战。

发明内容

本发明针对现有技术无法有效精准地修复Klhl18^lowf基因的问题，提供了一种CRISPR/Cas9系统，用以特异性靶向并修复Klhl18^lowf基因，从而治疗由Klhl18^lowf基因导致的感音神经性聋，可制备治疗感音神经性聋的药物。