[发明专利]一种利用核酸外切酶III检测大肠杆菌的方法及增强型试纸条

说明书

本发明公开了一种利用核酸外切酶III检测大肠杆菌O157:H7的方法和试纸条，该方法包括以下步骤：（1）将目标单链DNA和适配体加热，然后自然冷却至室温，得适配体‑目标DNA双链；（2）取适配体‑目标DNA双链与待测样品液混合，然后培养，离心，得上清液；（3）将所得上清液与发夹探针、核酸外切酶III混合，培养，结束后加热，冷却至室温；（4）取冷却至室温的溶液，添加到金标探针溶液中，孵育，得混合液；（5）将所得混合液滴到依序设有T线和C线的试纸条上，T线显色为阳性结果，T线不显色为阴性结果；所述T线固定有捕获探针，所述C线固定有质控线探针。与现有技术相比，本发明方法流程简单，试纸条检测灵敏准确。

技术领域

本发明属于大肠杆菌检测技术领域，尤其涉及一种利用核酸外切酶III检测大肠杆菌的方法及增强型试纸条。

背景技术

近年来，食源性致病菌已逐渐对食品的安全性造成严重的威胁，在诸多食品安全问题的报道中大肠杆菌引起的案例不断增加。注重致病菌的检测与防治不仅会保护消费者的健康而且也会减少相关产业的经济损失以及维护社会稳定性。

大肠杆菌O157:H7作为污染乳制品中常见的食源性致病菌，对消费者的健康乃至生命产生严重的威胁。因此建立一种有效的可用于现场监测乳中大肠杆菌O157:H7的检测技术至关重要。传统的培养方法耗时、耗材、操作步复杂，近年来，出现了一系列替代的检测技术，如磁分离、酶联免疫技术、电化学传感器、PCR等，这些检测技术虽然特异性、灵敏度都较好，但是需要复杂的检测程序、昂贵的仪器和专业的技术人员等，对于现场监测危害因子具有一定的局限性。传统试纸条具有检测快速、成本低、简单便捷等优点，且可肉眼观察检测结果，已被用于食品、药品的检测中。但是常常因为灵敏度低而无法检测出乳中微量的大肠杆菌O157:H7，因此创建一种便捷操纵简单的增强型试纸条对未来微量致病因子的检测具有重要意义。

目前通过增加检测线与标记物的结合量、利用新型材料作为标记物以及核酸扩增技术是增敏的主要方法，但是在增加检测线与标记物的结合量时往往需要复杂的化学修饰或者极易造成标记物的大量堆积造成可视效果不佳。而对于更换新型材料，其制备过程复杂且需要精密的检测仪器，部分新型材料如荧光粒子由于光漂白而容易猝灭，这使得基于荧光纳米粒子的检测技术不稳定，不适合大规模生产和长期储存。核酸扩增技术作为试纸条增敏的发展趋势避免了上述限制，但是基于PCR技术的增敏需要昂贵的大型仪器及专业人员，基于LAMP、SDA、RPA等增敏方法都需要繁琐的扩增流程，大部分技术应用在试纸条上快速检测致病菌时还需要特异性核酸的提取。

发明内容

发明目的：为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用核酸外切酶III 检测大肠杆菌的方法及增强型试纸条，该方法流程简单，检测灵敏准确。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用核酸外切酶III检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括以下步骤：

(1)将目标单链DNA和适配体加热，然后自然冷却至室温，得适配体-目标DNA 双链；

(2)取适配体-目标DNA双链与待测样品液混合，然后培养，离心，得上清液；

(3)将所得上清液与发夹探针、核酸外切酶III混合，培养，结束后加热，冷却至室温；

(4)取冷却至室温的溶液，添加到金标探针溶液中，孵育，得混合液；

(5)将所得混合液滴到依序设有T线和C线的试纸条上，T线显色为阳性结果，T 线不显色为阴性结果；所述T线固定有捕获探针，所述C线固定有质控线探针。

优选的，所述目标单链DNA、适配体、发夹探针、捕获探针和质控线探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5 所示。