[发明专利]重组蛋白质水凝胶培养支架及其制备方法

权利要求书

1.一种基于重组蛋白质水凝胶的培养支架制备方法，其特征在于，通过构建融合精-甘-天冬三肽序列的类节肢蚕丝重组蛋白表达载体，并将其导入表达宿主细胞中，经重组表达、分离纯化和温度刺激处理后，通过与海藻酸钠混合并经酶催化交联以及氯化钙和柠檬酸钠循环处理，得到动态纤维网水凝胶。

2.根据权利要求1所述的基于重组蛋白质水凝胶的培养支架制备方法，其特征是，所述的构建是指：利用反向PCR定点突变试剂盒将表达Arg-Gly-ASP(RGD)序列的基因整合到类节肢蚕丝重组蛋白(R₄S₈)₅的表达载体pET-19b3-R4S8-5，以构建融合RGD序列的类节肢蚕丝重组蛋白(R₄S₈)₅的表达载体pET-19b3-RGD-R4S8-5。

3.根据权利要求2所述的基于重组蛋白质水凝胶的培养支架制备方法，其特征是，所述的类节肢蚕丝重组蛋白是由类节肢弹性蛋白嵌段(R)和类蚕丝蛋白嵌段(S)所构成的融合蛋白，其氨基酸序列为[(GGRPSDSYGAPGGGN)₄-(GAGAGS)₈]₅；

所述的反向PCR定点突变所采用的正向引物RGD-F如Seq ID No.1所示，具体为：5’-CGTGGTGATATCGACGACGACGACAAG-3’，反向引物RGD-R如Seq ID No.2所示，具体为：5’-ATGGCCGCTGCTGTGATGATG-3’。

4.根据权利要求1所述的基于重组蛋白质水凝胶的培养支架制备方法，其特征是，所述的重组表达是指：将融合RGD序列的类节肢蚕丝重组蛋白表达载体pET-19b3-RGD-R4S8-5转入到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，对重组菌进行培养，并用异丙基硫代半乳糖苷诱导融合RGD序列的类节肢蚕丝蛋白的表达。

5.根据权利要求1所述的基于重组蛋白质水凝胶的培养支架制备方法，其特征是，所述的分离纯化是指：利用镍离子金属鳌合(Ni-NTA)亲和层析柱对表达得到的类节肢蚕丝蛋白分离纯化。

6.根据权利要求1所述的基于重组蛋白质水凝胶的培养支架制备方法，其特征是，所述的温度刺激是指：将纯化后的不同浓度的融合RGD序列的类节肢蚕丝蛋白放置在37℃的条件下孵育30分钟。

7.根据权利要求1所述的基于重组蛋白质水凝胶的培养支架制备方法，其特征是，所述的循环处理是指：向温度刺激后的5％(w/v)的融合RGD序列的类节肢蚕丝蛋白溶液中加入0.2％(w/v)海藻酸钠溶液、辣根过氧化物酶及过氧化氢，充分混匀后，在37℃条件下反应10分钟后，将其置于25mM的氯化钙溶液中浸泡30分钟即可得到初始水凝胶，将此初始水凝胶浸泡于α-MEM培养基中12小时后，将其分别浸泡于25mM、125mM和250mM的柠檬酸钠溶液中30分钟，然后将其浸泡于α-MEM培养基中12小时，之后依次循环上述氯化钙、培养基以及柠檬酸钠的浸泡体系后得到。

8.根据权利要求7所述的基于重组蛋白质水凝胶的培养支架制备方法，其特征是，所述的辣根过氧化物酶的酶活为600U/mL，过氧化氢的浓度为0.03％(w/v)。

9.一种根据权利要求1～8中任一所述方法制备得到的动态纤维网水凝胶，其特征在于，具有类天然胞外基质的纤维形貌且压缩模量在2-22kPa循环调控；

所述的循环调控，具体是：每24小时内，一次30分钟氯化钙浸泡后，进行11.5小时培养基浸泡，然后一次30分钟柠檬酸钠浸泡，再次进行11.5小时培养基浸泡。

10.一种根据权利要求1～8中任一所述方法制备得到或根据权利要求9所述动态纤维网水凝胶的应用，其特征在于，将其用于间充质干细胞的三维培养，具体为：将消化悬浮的BMSCs滴加到制备动态纤维网水凝胶支架的混合液中，待其形成水凝胶后，循环更换海藻酸钠、氯化钙和培养基的浸泡体系，即可用于BMSCs的三维培养。