[发明专利]重组蛋白质水凝胶培养支架及其制备方法

说明书

一种基于重组蛋白质水凝胶的培养支架及其制备方法，通过构建融合精‑甘‑天冬三肽(RGD)序列的类节肢蚕丝重组蛋白表达载体，并将其导入表达宿主细胞中，经重组表达、分离纯化和温度刺激处理后，通过与海藻酸钠混合并经酶催化交联以及氯化钙和柠檬酸钠循环处理，得到用于干细胞三维培养的动态纤维网水凝胶支架。本发明通过构建融合RGD序列的类节肢蚕丝重组蛋白，利用其温敏性成纤维自组装行为，制备适用于三维培养的重组蛋白质水凝胶基质，可有效调控间充质干细胞(BMSCs)的粘附、增殖、延展及分化等生命过程。

技术领域

本发明涉及的是一种生物医用材料领域的技术，具体是一种促进间充质干细胞生长分化的重组蛋白质水凝胶培养支架及其制备方法。

背景技术

高效修复由外伤或感染等因素造成的组织或器官的损伤目前仍是生物医学领域亟待解决的难题。因自体或异体移植存在来源不足、细胞活性及迁移率低等诸多问题，通过移植仿生的生物材料是目前修复损伤组织最有力的手段。理想的修复材料不仅可以作为惰性支持物为细胞生存提供场所，更重要是可以模拟细胞外基质的理化性质，以促进细胞的粘附及增殖等生命活动。细胞外基质作为由纤维束组成的凝胶状介质，其动态循环的降解与再生过程在调控细胞发育过程中发挥着极其重要的作用。目前，现有的水凝胶体系大多无法实现天然胞外基质类似的动态循环过程。因此，构建一种动态的仿生纤维网水凝胶可对生物医学及组织工程领域产生极其深远的影响。

现有的蛋白水凝胶制备技术，无法精细调控水凝胶的力学性能以调控干细胞的生长、分化等生命过程；不存在类天然胞外基质的纤维网络结构及动态调控过程，无法模拟细胞发育过程中，胞外基质的降解及再生的循环过程。

发明过程

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于重组蛋白质水凝胶的培养支架及其制备方法，利用融合RGD序列的类节肢蚕丝重组蛋白混合海藻酸钠，制备适用于间充质干细胞三维培养的仿生基质，可有效调控骨髓间充质干细胞(BMSCs)的粘附、增殖、延展及分化等生命过程。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种基于重组蛋白质水凝胶的培养支架制备方法，通过构建融合精-甘-天冬三肽(RGD)序列的类节肢蚕丝重组蛋白表达载体，并将其导入表达宿主细胞中，经重组表达、分离纯化和温度刺激处理后，通过与海藻酸钠混合并经酶催化交联以及氯化钙和柠檬酸钠循环处理，得到动态纤维网水凝胶。

所述的构建是指：利用反向PCR定点突变试剂盒(购自东洋纺株式会社)将表达Arg-Gly-ASP(RGD)序列的基因整合到类节肢蚕丝重组蛋白(R₄S₈)₅的表达载体pET-19b3-R4S8-5，以构建融合RGD序列的类节肢蚕丝重组蛋白的表达载体pET-19b3-RGD-R4S8-5。。

所述的类节肢蚕丝重组蛋白是由类节肢弹性蛋白嵌段(R)和类蚕丝蛋白嵌段(S)所构成的融合蛋白，其氨基酸序列为[(GGRPSDSYGAPGGGN)₄-(GAGAGS)₈]₅。

所述的反向PCR定点突变所采用的正向引物RGD-F如Seq ID No.1所示，具体为：5’-CGTGGTGATATCGACGACGACGACAAG-3’，反向引物RGD-R如Seq ID No.2所示，具体为：5’-ATGGCCGCTGCTGTGATGATG-3’。

所述的类节肢蚕丝重组蛋白表达载体pET-19b3-R4S8-5记载于《可控纤维化强化基因工程橡胶状蛋白质水凝胶》(Huang et al.Controllable FibrillizationReinforces Genetically Engineered Rubberlike Protein Hydrogels,Biomacromolecules 2021,22,961–970)。