[发明专利]重组人轮状病毒VP7蛋白的表达、免疫原性的分析方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，即重组人轮状病毒VP7蛋白的表达、免疫原性的分析方法。首先，根据GeneBank中已发表的VP7全序列（NC_007571.1）设计引物，通过对病料核酸提取，反转录cDNA为模板，克隆VP7基因后并构建表达载体pESP‑2‑VP7，转化粟酒裂殖酵母。经过1%IPTG诱导VP7表达，分离纯化，获得VP7蛋白，将VP7蛋白以不同免疫方式免疫小鼠评价其免疫保护效果。结果表明：引物设计与预测结果一致，克隆VP7基因长度为1050bp，SDS‑PAGE以及Western Blot鉴定结果表明其蛋白大小为63 kDa；VP7蛋白免疫小鼠后，其IgG、SIgA和中和抗体结果显示，50μg/只滴鼻免疫效果优于20μg/只滴鼻和注射组（50、20μg/只）；且滴鼻免疫具有较高的攻毒保护率为100%。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，即重组人轮状病毒VP7蛋白的表达、免疫原性的分析方法。探究轮状病毒VP7蛋白在粟酒裂殖酵母的表达，并鉴定评价其免疫保护效果。

背景技术

在现有技术中，轮状病毒（Rotavirus，RV）轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是一种肠道病毒。是引起婴幼儿急性胃肠炎的主要原因，每年约有87万婴幼儿死于轮状病毒引起的腹泻，是引起的腹泻和导致死亡的主要病原体之一，5岁以下儿童易感。据统计，全球每年约有2000万5岁以下儿童就诊，200万儿童住院。在RV疫苗未广泛接种的地区，有40%的儿童因轮状病毒所导致的急性肠胃炎而住院，而RV疫苗得到广泛接种的区域，因轮状病毒导致腹泻而住院的儿童比率下降了38%，疫苗开发有望减少全世界病毒病原体的负担，对其进行深入研究具有重要的公共卫生学意义。然而，当前生产的轮状病毒疫苗对生产和储存的条件要求较高，因此其成本较高，这限制了相对贫穷的地区儿童轮状病毒疫苗的接种。如何生产低成本且易于储存的轮状病毒疫苗便成为了当前迫切需要解决的问题。

最近报道，新型DS-1样G1P人轮状病毒在日本出现并快速传播。在泰国，发现了这种基因组间重配毒株，这意味着不寻常的轮状病毒毒株正在亚洲持续传播并发生了多重重组。同时轮状病毒自身也通过多种途径来拮抗固有免疫应答，并且系统发育分析揭示了在黎巴嫩标本的抗原表位中鉴定了几个替换，其VP4和VP7 基因具有较高的遗传变异性，为避免现有的诸多问题，导致部分疫苗存在崩溃的现象，研发成本不高且安全稳定的轮状病毒疫苗是必要的。目前，国内多家企业正在开展多价轮状病毒疫苗的研发工作，国外撒哈拉以南非洲正扩大轮状病毒疫苗的使用，疫苗开发有望减少全世界病毒病原体的负担。

轮状病毒外层表面的糖蛋白是结构基因vp7编码的VP7结构蛋白，也是轮状病毒的结构性中和抗原，能诱导产生IgG抗体和IgA抗体，与保护免疫有关4,5，因此以其作为靶蛋白，对与开发健康安全的RV疫苗有着重要的意义。当前，已经有越来越多利用酵母表达系统进行基因工程疫苗生产的研究，与其他表达系统相比，其具有成本低廉，易于遗传操作，遗传性状稳定，蛋白表达量高及翻译后修饰等优点。粟酒裂殖酵母是当前人来发现的第六个真核模式生物，被广泛用作分子遗传学和细胞生物学研究的模型系统来研究细胞分裂机制6。

由于目前尚无治疗轮状病毒性腹泻的特效药物，因此发展RV（Rotavirus，RV）疫苗是预防RV性腹泻的主要任务。轮状病毒是双链RNA病毒，具有两种形式：具有感染性的病毒粒子有双层衣壳；无感染性的病毒粒子无外衣壳。RV基因组是由11个不连续的dsRNA组成，其中6个基因节段编码病毒性的结构蛋白VP1-VP7，5个基因节段编码非结构蛋白NSP1-/NSP6。VP7和VP4蛋白决定RV的G型与R型以及其毒力。VP7蛋白是一种可结合Ca²⁺的糖蛋白，可激发人体产生体液免疫并诱导机体产生特异性中和抗体。

本申请利用粟酒裂殖酵母表达系统表达轮状病毒VP7蛋白，并进行免疫实验评估其免疫保护效果，以期为进一步研制经济、安全的RV转基因疫苗奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组人轮状病毒VP7蛋白的表达、免疫原性的分析方法，获得轮状病毒VP7基因的单克隆抗体，较现有的人轮状病毒疫苗检测方法及设备具有更加简单、特异性好的特点。