[发明专利]一种以新型载体递送的抗变异毒株保守靶标nCOVsiRNA的筛选方法

说明书

本发明涉及一种以新型载体递送的抗变异毒株保守靶标nCOVsiRNA的筛选方法，从不随病毒变异而变异的冠状病毒保守基因、超保守基因和/或保守微卫星中筛选siRNA，获得以保守基因为靶标、具有广谱抗变异毒株作用的siRNA，进而合成siRNA；并根据冠状病毒特异性感染ACE2表达细胞，及配体RBD与受体ACE2的关系，合成RBD或ACE2，并将合成的RBD或ACE2分别与合成的siRNA连接为以RBD为靶向递送载体的RBDnCoVsiRNA或以ACE2为靶向递送载体的ACE2nCoVsiRNA，其中RBD将CoVsiRNA递送给ACE2受体，通过ACE2受体通道进入靶细胞；而ACE2则将CoVsiRNA递送给病毒RBD，进而随病毒感染靶细胞而进入靶细胞。

技术领域

本发明涉及一种以新型载体递送的抗变异毒株保守靶标nCOVsiRNA的筛选方法，属于传染病防治的生物制药领域。

背景技术

新型冠状病毒的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)，其中S蛋白的N端由结构域(S1-NTD)和受体结合域 (S1-RBD)组成，新型冠状病毒通过其受体结合域S1-RBD与宿主细胞受体ACE2结合引起感染。

ACE2为I型跨膜糖蛋白，由805个氨基酸组成，包括跨膜区、胞内羧基端和胞外氨基端，冠状病毒通过其S1-RBD与ACE2的细胞外催化结构域互动结合，导致细胞内吞、膜融合，使病毒进入表达ACE2或含有ACE2受体的细胞。

RNA干扰(RNAi)作为一种高效的序列特异性基因沉默技术，正在给疾病的治疗带来难以想象的应用前景，已有多种siRNA药物被FDA审批上市。小干扰RNA(siRNA)大约21～23bp，以参与RNA干扰(RNAi)的方式调节基因表达,特异性降解与之互补的靶信使RNA(mRNA)，但无论是细胞水平还是活体内，使用siRNA进行基因干扰均要克服很多困难：1)膜通透性：siRNA 带有大量的负电荷，分子量大(～13KD)，自身很难穿过细胞膜，运输siRNA主要靠化学修饰和一些运输载体；2)抗核酸酶降解：siRNA由大量的核糖核酸分子构成，很容易被外界的 RNA酶降解，如果在设计siRNA及选择运输载体时不对碱基进行特定的化学修饰或采取载体保护方法，则在siRNA进入作用位点前即被RNA酶降解；3)靶向递送及载体：siRNA的作用位点主要在靶细胞浆内，所以需将siRNA特异性递送给靶细胞浆，如果不能有效地选用合适的靶向递送载体并及时使siRNA从内涵体释放到胞浆，通常可激活细胞免疫反应，导致干扰素等细胞因子的释放，所以，如何有效地将siRNA运输并释放到靶细胞浆是影响RNAi效果的瓶颈问题，有些siRNA能导致序列或浓度依赖性非特异性基因沉默即脱靶，因此，在设计 siRNA时，应同时考虑靶向递送、基因抑制效果以及尽可能选择低脱靶效应的序列。

文献报道，DXMV、V1、V2、NJ1和NJ1-17这5个犬冠状病毒流行株的M基因核苷酸同源性为96.6％，显示出很高的保守性(犬冠状病毒流行株膜蛋白基因序列分析及其表达研究，中国病毒学，2006年21卷5期)，说明M基因为保守基因，是在病毒进化中保持不变或几乎不变的基因序列，或各种病毒之间的相同基因序列，换句话说，保守序列就是指不管冠状病毒或其全基因组发生怎样的变异，但总有某些基因序列是保持相对稳定或不变的，所以，只要降解了病毒的保守序列，就会影响病毒其他基因的装配，从而抑制整体病毒的复制。

在COVID-19的防治中，如果能以合适的靶向递送载体将nCoVsiRNA稳定地、特异地递送给靶器官、靶组织、靶细胞、穿越靶细胞膜、释放到靶细胞浆，并以保守基因为靶标，就能对多种变异毒株产生广谱的RNAi作用，从而更好地开展COVID-19的靶向基因治疗。

所以，本发明要设计以新型载体递送的抗变异毒株保守靶标nCOVsiRNA的筛选方法。

发明内容

本发明的目的是要提供一种以保守基因为靶标的nCOVsiRNA筛选方法以及以RBD或 ACE2靶向递送nCOVsiRNA的RBDnCOVsiRNA或ACE2nCOVsiRNA的制备方法。