[发明专利]一种克雷伯氏菌工程菌及其在生产乙醇中的应用

权利要求书

1.一种克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）工程菌，其特征在于，所述工程菌过表达乙醛脱氢酶大亚基aldh基因，所述的乙醛脱氢酶大亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；

编码所述的乙醛脱氢酶大亚基aldh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

2.一种如权利要求1所述克雷伯氏菌工程菌的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)提取的克雷伯氏菌的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，并采用引物对ALF1/ALR1扩增乙醛脱氢酶大亚基aldh基因；

(3)将纯化的基因扩增片段连接pUCm-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并测序验证；

(4)采用引物对ALF11/ALR11扩增含酶切位点的aldh基因，按上述方法转化、筛选阳性克隆并测序验证获得重组质粒aldh-pUCm-T；

(5)重组质粒aldh-pUCm-T双酶切后将目的基因片段连接pET-28a载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，卡那霉素抗性筛选，构建过表达质粒aldh-pET-28a，测序验证；

(6)扩增提取aldh-pET-28a，进一步转化克雷伯氏菌感受态细胞即得克雷伯氏菌工程菌。

3.根据权利要求2所述的一种克雷伯氏菌工程菌的制备方法，其特征在于：

aldh基因克隆所用的引物序列如下：

ALF1：5’-ATGCGTAAACGTAAAGTCGCC-3’

ALR1：5’-TCATGCTGTCGCTCCCGCC-3’

aldh基因亚克隆所用的引物序列如下：

ALF11：5’-GCGGCCGC ATGCGTAAACGTAAAGTCGCC-3’

ALR11：5’-CTCGAGTCATGCTGTCGCTCCCGCC-3’。

4.一种如权利要求1所述克雷伯氏菌工程菌在乙醇生产中的应用，其特征在于，具体步骤如下：

将活化好的克雷伯氏菌工程菌单菌落接种3 mL含卡那霉素抗性的种子培养基过夜培养；次日接种于新鲜的30 mL 种子培养基中，培养2 h，加入过滤灭菌的IPTG至终浓度1mmol/L，37℃继续诱导培养6 h；进一步按10%接种量接入发酵培养基，所述发酵培养基的起始糖浓度50 g/L，起始pH 7.5，IPTG诱导浓度1 mmol/L，于37℃、180 r/min振荡培养12 h，之后转入第二段厌氧发酵，37℃恒温培养至72 h；离心收集发酵上清液，用于检测乙醇、葡萄糖和木糖浓度。