[发明专利]一种克雷伯氏菌工程菌及其在生产乙醇中的应用

说明书

本发明公开了一种克雷伯氏菌工程菌及其在生产乙醇中的应用，包括宿主菌和转入所述宿主菌的质粒载体，所述质粒载体中导入了催化短链醇合成的氧化还原酶亚基基因，或导入了乙醛脱氢酶大亚基基因并实现了这两个基因的过表达。本发明还提供了一种上述生产乙醇工程菌的构建方法和应用。获得的工程菌株保持了高效利用木质纤维素水解液中木糖和葡萄糖的发酵性能，获得了提高的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活性及乙醇产量，实现了木质纤维素水解液的有效利用和生物乙醇的高效生产。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种合成生物乙醇的克雷伯氏菌工程菌及其构建方法和在纤维素乙醇生产中的应用。

背景技术

近年来，木质纤维素资源因其储量丰富和可再生性，以其为原料生产乙醇已成为燃料乙醇领域的研究热点。如何提高过程效率、降低生产成本是关乎纤维素乙醇高效生产的重点，亦是决定其产业化的关键。酿酒酵母或运动发酵单胞菌是用于乙醇发酵的主要微生物菌株，但其不能分解利用纤维素，亦不能有效转化利用木质纤维素水解液中的木糖，使其在纤维素燃料乙醇生产中不具优势。克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)是工业生产中重要的发酵菌种，用于多种生物基化学品如1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、生物氢等的发酵生产中。此外，克雷伯氏菌还有较广的基质利用特性，尤其是有的野生菌株能利用木质纤维素水解液进行生物基化学品的发酵生产，如，一株Klebsiella oxytoca被报道能够发酵玉米芯酸解液生产2,3-丁二醇，一株Klebsiella oxytoca被报道能够发酵麻风树皮酸解液生产2,3-丁二醇。在克雷伯氏菌中，乙醇是伴随一些生物基化学品产生的重要代谢物，例如，本实验室筛选的一株克雷伯氏菌(Klebsiella sp.WL1316)能利用木质纤维素水解液中葡萄糖和木糖高效合成生物氢，在其发酵产氢过程中，亦可积累较高浓度的乙醇。然而，迄今，较少研究涉及克雷伯氏菌工程菌用于生物乙醇的生产。

尽管本实验室的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.WL1316)野生菌能在发酵产氢过程中积累较高浓度的乙醇，但仍以生物氢合成支路的代谢流分布最高。为此，基于该Klebsiella sp.WL1316的全基因组信息(该基因组数据已提交NCBI SRA数据库并获得BioProject登录号PRJNA611005)，通过同源超量表达其乙醇合成途径中的关键酶——乙醇脱氢酶adh基因和乙醛脱氢酶aldh基因，实现该菌株乙醇合成代谢途径的强化，获得既能有效利用木质纤维素水解糖液又能高效合成乙醇的工程菌株，为纤维素乙醇的生产提供高效的工程菌株和廉价的生产方式。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：如何重组改造克雷伯氏菌(Klebsiella sp.WL1316)野生菌，通过同源超量表达其乙醇合成途径中的关键酶实现该菌株乙醇合成代谢途径的强化。

为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：

一种克雷伯氏菌工程菌，所述工程菌过表达催化短链醇合成的氧化还原酶亚基adh基因和乙醛脱氢酶大亚基aldh基因，所述的催化短链醇合成的氧化还原酶亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的乙醛脱氢酶大亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

编码所述催化短链醇合成的氧化还原酶亚基的adh基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，编码所述的乙醛脱氢酶大亚基的aldh基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种上述克雷伯氏菌工程菌的制备方法，具体步骤如下：

(1)提取的克雷伯氏菌的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，并采用引物对ADF1/ADR1、ALF1/ALR1分别扩增催化短链醇合成的氧化还原酶亚基adh基因和乙醛脱氢酶大亚基aldh基因；

(3)将纯化的基因扩增片段连接pUCm-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并测序验证；