[发明专利]一种(β,S)构型羟丙基四氢吡喃三醇的结晶方法

权利要求书

1.一种(β,S)构型羟丙基四氢吡喃三醇的结晶方法，其特征在于，所述(β,S)构型羟丙基四氢吡喃三醇的结晶方法具体包括以下步骤：

(1)在羰基还原酶和辅酶再生酶的存在下，D-吡喃木糖苷-2-(S)丙酮发生不对称还原反应，得到(β,S)构型羟丙基四氢吡喃三醇的粗品；

(2)将步骤(1)得到的反应体系依次进行萃取、浓缩和结晶，得到(β,S)构型羟丙基四氢吡喃三醇的晶体。

2.根据权利要求1所述的(β,S)构型羟丙基四氢吡喃三醇的结晶方法，其特征在于，步骤(1)中，所述辅酶再生酶包括甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或醇脱氢酶中的任意一种或至少两种的组合。

3.根据权利要求1所述的(β,S)构型羟丙基四氢吡喃三醇的结晶方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作为：将D-吡喃木糖苷-2-(S)丙酮、共底物以及含羰基还原酶和辅酶再生酶液体混合，进行保温反应，得到含(β,S)构型羟丙基四氢吡喃三醇的粗品的反应液。

4.根据权利要求3所述的(β,S)构型羟丙基四氢吡喃三醇的结晶方法，其特征在于，在反应体系中，所述D-吡喃木糖苷-2-(S)丙酮的浓度为20-1000g/L，优选为100-200g/L；

优选地，所述共底物与含羰基还原酶和辅酶再生酶液体的体积比为(0.5-2):1，优选为1:1；

优选地，所述共底物包括异丙醇水溶液、葡萄糖水溶液或甲酸水溶液中的任意一种或至少两种的组合，优选异丙醇水溶液；

优选地，所述共底物的质量百分含量为30-50％；

优选地，所述保温反应的温度为25-30℃；

优选地，所述保温反应的时间为8-24h，优选为10-12h。

5.根据权利要求3或4所述的(β,S)构型羟丙基四氢吡喃三醇的结晶方法，其特征在于，所述含羰基还原酶和辅酶再生酶液体由以下制备方法制备得到：

(a)将羰基还原酶和辅酶再生酶重组后，与工程大肠杆菌共同接种于液体培养基中进行培养；

(b)通过对步骤(a)培养得到的体系进行离心，收集菌体；将菌体置于缓冲溶液后破碎，再通过离心收集上清液，得到含羰基还原酶和辅酶再生酶液体；

优选地，步骤(a)中，所述重组具体包括以下步骤：提取基因组、羰基还原酶基因克隆、E.coli/pET-28a(+)-KR01重组工程菌的构建及表达；

优选地，所述提取得到的基因组为Streptomyces cyaneogriseus和Rhodococcusruber DSM 44541基因组；

优选地，所述羰基还原酶基因克隆包括以下步骤：将提取得到的基因组依次通过密码子优化及化学合成羰基还原酶基因、从微生物基因组中克隆羰基还原酶基因、定点突变克隆羰基还原酶基因，得到pET-28a(+)-LK02和pET-28a(+)-LK03质粒；

优选地，所述E.coli/pET-28a(+)-KR01重组工程菌的构建及表达包括以下步骤：将克隆得到的质粒分别转化至BL21(DE3)感受态细胞，获得分别表达KR01、KR02羰基还原酶的重组工程菌。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的(β,S)构型羟丙基四氢吡喃三醇的结晶方法，其特征在于，步骤(2)中，所述萃取用溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯或甲酸甲酯中的任意一种或至少两种的组合，优选为乙酸乙酯。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的(β,S)构型羟丙基四氢吡喃三醇的结晶方法，其特征在于，步骤(2)中，所述结晶的具体步骤为：将浓缩后的产物与结晶溶媒混合后，依次进行搅拌结晶、降温养晶、过滤、洗涤和干燥，得到(β,S)构型羟丙基四氢吡喃三醇的晶体。