[发明专利]一种羰基还原酶及利用该酶制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法

权利要求书

1.一种羰基还原酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的羰基还原酶的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种含有权利要求2所述的编码基因的重组载体或重组菌。

4.权利要求1所述的羰基还原酶和权利要求3所述的重组载体或重组菌在催化4-氯乙酰乙酸乙酯转化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

5.一种制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：将4-氯乙酰乙酸乙酯溶于正辛醇，得到油相；将表达权利要求1所述的羰基还原酶的工程菌湿细胞、表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞、葡萄糖和NADPH加入到磷酸盐缓冲液中，得到水相；将油相和水相混合，调节pH值，于室温下搅拌反应；反应结束后用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标化合物(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的表达权利要求1所述的羰基还原酶的工程菌湿细胞的构建方法为：将权利要求1所述的羰基还原酶的编码基因导入pET28a，酶切位点为NdeI、EcoRI，得到重组质粒，然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，即得。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞的构建方法为：将如SEQ ID NO.3所示的葡萄糖脱氢酶的编码基因导入pET28a，酶切位点为NdeI、EcoRI，得到重组质粒，然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，即得。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的4-氯乙酰乙酸乙酯、表达权利要求1所述的羰基还原酶的工程菌湿细胞、表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞和葡萄糖的质量比为(10～80):1:1:1.5；所述的葡萄糖与NADPH的质量比为(25～100):1。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液为0.1mol/L，pH＝7.5的KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液；所述的正辛醇与磷酸盐缓冲液的体积比为1:(2～20)。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的调节pH值为调节pH至7，所述反应的反应时间为2～3h。