[发明专利]一种羰基还原酶及利用该酶制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法

说明书

本发明公开了一种羰基还原酶及利用该酶制备(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的方法。该羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的制备步骤为：将4‑氯乙酰乙酸乙酯溶于正辛醇，得到油相；将表达羰基还原酶的工程菌湿细胞、表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞、葡萄糖和NADPH加入到磷酸盐缓冲液中，得到水相；将油相和水相混合，调节pH值，于室温下搅拌反应；反应结束后用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标化合物(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯。本发明方法反应时间短，产物的ee＞99.5％，收率为97％，转化率为100％，显著优于现有的技术水平。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶及利用该酶制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。

背景技术

4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)，是一种重要的有机合成的中间体，可经由氯的置换反应，还原反应等，引入多种药物中间体。例如：(R)-CHBE可以用来合成减肥营养补充品L-肉碱。目前以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为原材料来制备CHBE主要有化学法和生物催化法两种方法。化学合成方法反应条件苛刻，需在高温、高压条件下反应，能耗较高且对反应器要求苛刻，同时使用的金属催化剂价格昂贵成本较高。生物催化合成CHBE具有效率高、立体选择性高、成本低、绿色环保等优势，近年来受到广泛关注。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种羰基还原酶及利用该酶制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。

本发明通过使用生物信息学的挖掘手段，挖掘出活力和立体选择性较高的羰基还原酶CR1。同时构建了辅酶循环再生反应体系(将羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶同时加入反应体系)，提供一种绿色环保、成本较低、产物光学纯度高的(R)-CHBE的制备方法。

本发明的第一个目的是提供一种羰基还原酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的羰基还原酶分离自酵母菌。

本发明的第二个目的是提供一种上述羰基还原酶的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述编码基因的重组载体或重组菌。

本发明的第四个目的是提供上述的羰基还原酶，以及表达该羰基还原酶的重组载体或重组菌在催化4-氯乙酰乙酸乙酯转化制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，该制备方法包括以下步骤：将4-氯乙酰乙酸乙酯溶于正辛醇，得到油相；将表达羰基还原酶的工程菌湿细胞、表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞、葡萄糖和NADPH加入到磷酸盐缓冲液中，得到水相；将油相和水相混合，调节pH值，于室温下搅拌反应；反应结束后用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标化合物(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

进一步的，所述的表达羰基还原酶的工程菌湿细胞的构建方法为：将上述的羰基还原酶的编码基因导入pET28a，酶切位点为NdeI、EcoRI，得到重组质粒，然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，即得。

进一步的，所述的表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞的构建方法为：将如SEQ IDNO.3所示的葡萄糖脱氢酶的编码基因导入pET28a，酶切位点为NdeI、EcoRI，得到重组质粒，然后将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)，即得。