[发明专利]一种核酸检测方法

说明书

本发明公开了一种核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)待测核酸序列的扩增：所用的正向引物和反向引物均为带有标记物的特异性扩增引物，扩增产物为双链DAN产物，所述双链DNA产物两端均带有标记物；2)对扩增的双链DNA产物进行检测：所用检测工具为层析试纸条，所述层析试纸条含有显色物，所述显色物附着有能够与步骤1)中的标记物结合的配对标记物，检测温度为室温，检测结果通过层析试纸条的显色判断；所述层析试纸条自样品端至手柄端依次形成有显色物线、靶标检测线和质控检测线；仅当标靶检测线和质控检测线均显色时，判断为阳性。本发明检测时间短，无需使用特定的检测仪器，成本较低，准确度高，且操作方便。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种核酸检测方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种用于生物体外复制扩增特定DNA片段的分子生物学技术。1983年，由Mullis首先提出设想，并于1985年发明了聚合酶链反应。PCR原理：利用DNA在体外95℃时变性形成单链；～60℃时引物与单链按碱基互补配对的原则结合；DNA聚合酶在～72℃沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链，使得PCR得到的产物通常为双链DNA。

等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)也是核酸体外扩增技术的一种，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。常见的等温扩增技术有以下几种：环介导核酸等温扩增技术(LAMP)、滚环扩增技术RCA、单引物等温扩增SPIA、依赖解旋酶的等温扩增技术HAD、链替代扩增SDA等技术。

标记免疫分析技术是利用抗原抗体的特异性反应和标记技术的放大效应进行定性和定量测试的一种分析技术，其主要优点是灵敏度高、特异性高，因此，测试结果更准确。

目前，传统的核酸检测方法存在检测时间长，对检测温度等环境要求较高，且需要使用特定的检测仪器，因此，检测成本较高。为此，本发明拟开发一种室温下的核酸检测方法，能缩短检测时间，无需使用特定的检测仪器，成本较低，准确度高，且操作方便。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种核酸检测方法，结合了扩增技术及标记免疫分析技术，能够实现对DNA或RNA(需先逆转录)模板在扩增后的产物，在室温条件下通过显色直接判断样本的检测结果，检测时间短，无需使用特定的检测器，成本较低，准确度高，且操作方便。

为解决上述技术问题，本发明提供的核酸检测方法，包括如下步骤：

1)待测核酸序列的扩增：所用的正向引物和反向引物均为带有标记物的特异性扩增引物，扩增产物为双链DAN产物，所述双链DNA产物两端均带有标记物；

2)对扩增的双链DNA产物进行检测：所用检测工具为层析试纸条，所述层析试纸条含有显色物，所述显色物附着有能够与步骤1)中的标记物结合的配对标记物，检测温度为室温，检测结果通过层析试纸条的显色判断；

所述层析试纸条自样品端至手柄端依次形成有显色物线、靶标检测线和质控检测线；

仅当标靶检测线和质控检测线均显色时，判断为阳性。

上述方案为扩增技术与标记免疫分析技术结合，利用层析试纸条直接检测扩增后的待测核酸序列，且扩增产物的端部带有标记物，层析试纸条的显色物带有配对标记物，标记物与配对标记物结合使得显色物聚集显色而达到测出待测核酸序列的目的。

具体的，步骤1)中所述正向引物和反向引物的标记物为荧光素或生物素；步骤2)中的所述配对标记物为荧光素或生物素抗体；标记物与配对标记物优选为如下抗原抗体组合中的一种：生物素-抗生物素抗体、或FITC-抗FITC抗体、或FAM-抗FITC抗体、或地高辛和抗地高辛抗体、或TAMRA和抗TAMRA抗体。