[发明专利]基于CRISPR检测脑卒中相关TYMS基因的试剂盒

说明书

本发明属于基因突变检测技术领域，公开了基于CRISPR检测脑卒中相关TYMS基因的试剂盒，所述试剂盒包括针对TYMS基因rs699517和rs2790位点设计的突变型crDNA或突变型crRNA，其序列如SEQ ID NO.1～4所示，结合CRISPR‑cas12a系统，能确定待测样本中是否存在TYMS基因rs699517和/或rs2790位点的基因突变，具备特异性强、准确性高、检测速度快等优点，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于基因突变检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR检测脑卒中相关TYMS基因突变的试剂盒。

背景技术

脑卒中又称中风，是一种复杂的多因素多基因疾病，由多种基因-基因和基因-环境相互作用引起。多种因素包括高血压、糖尿病、吸烟、高脂血症和高同型半胱氨酸血症，都与较高的中风风险相关。特别是高同型半胱氨酸血症，被认为是多民族缺血性中风的一个独立的、潜在的可改变的危险因素。研究表明，高血压、空腹血糖受损和高同型半胱氨酸血症被认为是脑血管疾病的独立危险因素，而这种风险的分子基础归因于叶酸循环、蛋氨酸循环和胸苷酸合成酶(DNA修复)中因子的异常功能，这些因子参与单碳代谢。例如，同型半胱氨酸(Hcy)和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)直接参与蛋氨酸的合成，并导致与高同型半胱氨酸血症相关的脑血管疾病风险。

最近，有研究调查了叶酸与中风的关系，在随机对照试验中，叶酸摄入有助于预防中风。因此，脑血管疾病的风险受Hcy和叶酸的影响，叶酸是预防血管疾病的候选营养素。胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase，TYMS)是参与叶酸代谢的酶之一。具体而言，TYMS分别催化5,10-亚甲基四氢叶酸(THF)和脱氧尿苷单磷酸(dUMP)转化为5-甲基THF-脱氧胸苷单磷酸(dTMP)。这种转化需要5,10-甲基THFA作为底物来生成胸苷(dTMP)，这是DNA合成和修复所需的核苷酸。因此，TYMS在叶酸代谢中起着至关重要的作用，而叶酸代谢是DNA合成和修复的关键组成部分。编码这些因子的基因异常可导致多种问题，包括MTHFR降低和胸苷酸合成酶(TS)水平升高，这可能通过同型半胱氨酸积累、叶酸缺乏或两者兼而有之导致心血管疾病。

由于TYMS参与DNA修复机制，TYMS基因的遗传变异已在癌症治疗学中被报道和研究。此外，TYMS基因多态性已在血管疾病中进行了研究，并显示与疾病风险相关。并且TYMS基因多态性对缺血性卒中和SBI易感性及进展的影响也已被研究。研究表明TYMS多态性(1100TC[rs699517]、1170AG[rs2790]])与缺血性中风和无症状性脑梗塞(SBI)的相关性。

现阶段临床一般通过定量即时聚合酶链锁反应(Quantitative real timepolymerase chain reaction，Q-PCR)、非放射性原位杂交技术(fluorescence insituhybridization，Fish)、多重引物PCR(multiplex PCR)等方式对患者进行基因突变检测，然而这些检测技术均存在检测时间长过程复杂或检测成本过高等问题，导致无法应用到大规模的临床样本研究中。因此亟需提供一种温度控制简单，且灵敏度、特异性高的特异性片段检测方法。

RNA引导的成簇规则间隔短回文重复序列-CRISPR(CRISPR-Cas)相关方法由于其高可靠性和特异性而在快速核酸检测方面显示出相当大的前景。目前已经开发了几种类型的Cas核酸酶用于CRISPR-Cas系统，例如Cas9、Cas12等。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于解决现有技术中检测时间长、成本过高和准确性不高以致无法大规模检测临床样本基因突变的问题，提供了一种基于CRISPR技术检测与脑卒中相关的TYMS基因是否存在rs699517和/或rs2790目标突变位点和检测该靶核酸在目标区域是否存在突变的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明具体采用以下技术方案：

一种检测试剂盒，该试剂盒包括突变型crDNA或突变型crRNA；