[发明专利]大肠杆菌的高密度培养及在催化生产槲皮素中的应用

说明书

本发明公开了大肠杆菌的高密度培养及在催化生产槲皮素中的应用，属于发酵工程及生物医药技术领域。本发明通过优化发酵培养基，使构建的重组菌株获得较高浓度的菌体密度，且具有较好的全细胞催化活性。将高密度发酵获得的重组大肠杆菌作为催化剂进行全细胞催化，可在4‑6h内催化40g/L的底物芦丁完全水解生成槲皮素。

技术领域

本发明涉及大肠杆菌的高密度培养及在催化生产槲皮素中的应用，属于发酵工程及生物医药技术领域。

背景技术

槲皮素是一种黄酮醇，存在于多种蔬菜和草药中，含有许多有利的生物活性，能帮助健康细胞增殖，提高心血管免疫。槲皮素具备抗氧化属性，能够清除自由基，帮助细胞调节，促进DNA完整性等。另外，槲皮素还能帮助身体在氧化应激中保持足够的谷胱甘肽水平，支持免疫调节。槲皮素在清除自由基方面具有显著的效果，是药用植物的活性成分之一，相关药理和临床实验证明槲皮素具有广泛的药用价值，现代药理研究表明槲皮素具有抗炎、抗氧化、抑制肿瘤细胞生长等药理活性。此外，槲皮素还可以治疗慢性支气管炎、冠心病及高血压等疾病。槲皮素是许多类黄酮的基础结构，如芦丁，异槲皮苷。同时，槲皮素环结构也是更大的类黄酮分子的一部分存在，比如金丝桃中的高糖，银杏中的黄酮糖苷等。槲皮素比较容易从芦丁中提取获得，常常被添加到保健品中。然而，槲皮素很少在自然中直接存在，且在小肠的吸收表面不易被主动吸收，它的吸收只能依靠更慢速、更低效的被动扩散过程进行。

目前，异槲皮素和槲皮素的制备方法有：1.从天然植物中分离提取，如“从生物类黄酮中回收异槲皮素”等方法，但这类方法要使用大量的有机溶剂，不利于清洁生产，并且产率低，成本高，很难实现产业化生产；2.用酶法水解芦丁制备异槲皮苷和槲皮素，比如“酶法水解制备异槲皮素和槲皮素的方法”，该方法需要使用昂贵的生物酶制剂，工艺设备也较复杂，生产成本较高。槲皮素的工业化生产一般采用强酸水解芦丁的工艺，对生产设备的防腐要求较高，且产生三废，不利于环境保护。微生物法比较经济而且操作方便安全。但是，全细胞催化生产需要足够的菌体量，如果培养大肠杆菌直接采用TB培养基，容易导致发酵成本太高。因此，为了在减少发酵成本的同时获得较高菌体量，亟待开发更加高效的发酵方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种高密度发酵方法，从而提高重组大肠杆菌发酵的菌体量。

本发明提供了一种能够利用芦丁生产槲皮素的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达嗜热链球菌来源的L-鼠李糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶。

在一种实施方式中，所述L-鼠李糖苷酶DthRha具有如Genbank登录号WP_012548615.1所示的氨基酸序列；所述β-葡萄糖苷酶Dth3具有如Genbank登录号ACI19278.1所示的氨基酸序列。

在一种实施方式中，编码所述DthRha的基因序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述Dth3的基因序列SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pET系列载体为中的pRSFduet-1为表达载体。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为宿主。

本发明还提供含所述重组大肠杆菌的细胞催化剂；所述细胞催化剂包括但不限于所述重组大肠杆菌的细胞培养液或固定化细胞。

本发明还提供了所述重组大肠杆菌的高密度发酵方法，是将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基中，使接种后的OD达0.08以上，于35～37℃发酵，发酵12h时后降温至30℃，并且开始补料，补料流速为20mL/h；发酵过程溶氧控制为40％，pH为7.0。