[发明专利]一种T细胞向肿瘤迁移的负调控因子的体外筛选、鉴定方法

权利要求书

1.一种免疫细胞向肿瘤迁移的负调控因子的体外筛选、鉴定方法，其特征在于，所述的筛选方法、鉴定方法包括：

步骤1、采用SLICE技术对免疫细胞进行基因组编辑；

步骤2、采用嘌呤霉素puro筛选稳定表达的经基因组编辑的免疫细胞并进行扩增培养；

步骤3、将扩增培养后的经基因组编辑的免疫细胞在驱动剂的作用下进行Transwell迁移实验，分别收集Transwell上室和下室中的细胞，比较基因未敲除和基因敲除后的细胞迁移效率变化和/或提取基因组DNA，通过PCR扩增基因组中的sgRNA所对应的DNA序列，并对扩增后的DNA序列进行二代测序。

2.根据权利要求1所述的体外筛选、鉴定方法，其特征在于，所述的免疫细胞为T细胞。

3.根据权利要求1所述的体外筛选、鉴定方法，其特征在于，所述的驱动剂为趋化因子、肿瘤细胞的培养上清液或实体瘤中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的体外筛选、鉴定方法，其特征在于，所述的驱动剂为趋化因子CXCL9和/或趋化因子CXCL10，在经基因组编辑的T细胞表面的CXCR3表达水平最高的时段进行Transwell迁移实验。

5.根据权利要求1或4所述的体外筛选、鉴定方法，其特征在于，所述的步骤1包括：

步骤a1、采用sgRNA文库慢病毒感染免疫细胞；

步骤a2、向步骤a1中的感染后的免疫细胞中电转Cas9蛋白；

步骤a3、电转结束后，加入不含IL-2的培养基于30~40℃下孵育20~50 min，

其中，步骤a2中使用的电转体系为100μL Lonza电转buffer中溶解5×10⁶~10×10⁶个免疫细胞和3~5μM Cas9蛋白，

步骤a3中使用的培养基的配方为：

RPMI-1640培养基 200~300 mL；

X-vivo15 media无血清细胞培养基 200~300 mL；

谷氨酰胺 2~8 mL；

青霉素-链霉素溶液 2~8 mL；

FBS胎牛血清 5 %~15 %。

6.根据权利要求5所述的体外筛选、鉴定方法，其特征在于，所述的免疫细胞为CD3⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞或CD8⁺ T细胞中的一种或多种；

孵育结束后，加入40~60μMβ-巯基乙醇，5~15 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0.5~1.5 mM丙酮酸钠，80~120μM NEAA细胞培养添加物，2~8ng/mL IL-15，5~15 ng/mL IL-7，400~600IU/ml IL-2继续培养60~84 h。