[发明专利]一种T细胞向肿瘤迁移的负调控因子的体外筛选、鉴定方法

说明书

本发明提供一种免疫细胞向肿瘤迁移的负调控因子的体外筛选、鉴定方法。为了寻找能够驱动T细胞向肿瘤迁移的负调控基因，本发明的体外筛选、鉴定方法包括：步骤1、采用SLICE技术对免疫细胞进行基因组编辑；步骤2、采用嘌呤霉素puro筛选稳定表达的经基因组编辑的免疫细胞并进行扩增培养；步骤3、将扩增培养后的经基因组编辑的免疫细胞在驱动剂的作用下进行Transwell迁移实验，分别收集Transwell上室和下室中的细胞并进行基因测序分析。本发明适用于趋化因子、肿瘤细胞培养上清及肿瘤对免疫细胞的驱动作用，适用于各种免疫细胞向肿瘤迁移的负调控因子的筛选或鉴定，将大大推进抗肿瘤免疫治疗的发展。

技术领域

本发明属于抗肿瘤免疫治疗领域，具体涉及一种T细胞向肿瘤迁移的负调控因子的体外筛选、鉴定方法。

背景技术

随着人类对免疫系统和肿瘤发生机制的深入认识，2015年，一种名叫“免疫疗法”的肿瘤治疗方式被提出，并且随着近年来的发展彻底改变了肿瘤治疗的格局，成为对抗肿瘤的有力武器。其中，免疫疗法的主力军T细胞迁移至肿瘤是抗肿瘤免疫治疗领域中改善免疫治疗疗效的主要策略之一。

在T细胞肿瘤免疫循环过程中，促进T细胞向肿瘤迁移在抗肿瘤免疫中发挥重要作用，然而T细胞迁移到肿瘤的能力是否受到基因调控仍缺乏报道。揭示影响T细胞向肿瘤迁移的基因调控网络对促进抗肿瘤免疫治疗领域的发展至关重要。然而一个主要的挑战是如何对驱动T细胞向肿瘤迁移的调控基因进行系统性分析。迄今为止，没有文献报道过如何对T细胞向肿瘤迁移的调控因子进行筛选，因此开发一种免疫细胞向肿瘤迁移的负调控因子的体外筛选、鉴定方法成为重中之重。

发明内容

本发明的目的是提供一种免疫细胞向肿瘤迁移的负调控因子的体外筛选、鉴定方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种免疫细胞向肿瘤迁移的负调控因子的体外筛选、鉴定方法，所述的筛选方法包括：

步骤1、采用SLICE技术对免疫细胞进行基因组编辑；

步骤2、采用嘌呤霉素puro筛选稳定表达的经基因组编辑的免疫细胞并进行扩增培养；

步骤3、将扩增培养后的经基因组编辑的免疫细胞在驱动剂的作用下进行Transwell迁移实验，分别收集Transwell上室和下室中的细胞，比较基因未敲除和基因敲除后的迁移效率变化和/或提取基因组DNA，通过PCR扩增基因组中的sgRNA所对应的DNA序列，并对扩增后的DNA序列进行二代测序。

优选地，所述的免疫细胞为T细胞。

优选地，所述的驱动剂为趋化因子、肿瘤细胞的培养上清液或实体瘤中的一种或多种。

进一步优选地，所述的驱动剂为趋化因子CXCL9和/或趋化因子CXCL10，在经基因组编辑的T细胞表面的CXCR3表达水平最高的时段内进行Transwell迁移实验。

在本研究中，发明人大胆设想了一种鉴定T细胞向肿瘤迁移的负调控因子的体外筛选平台：分别以趋化因子CXCL9/10、后期将要用到的肿瘤细胞的培养上清液、甚至是人的肿瘤等作为“驱动剂”，利用Transwell迁移实验，让已经分别被敲除不同基因的混合T细胞向加入了普通培养基的下室以及向加入了含上述“驱动剂”的培养基中迁移，最后分别收集未发生迁移和迁移到培养基中的细胞，分别提取基因组DNA，通过PCR扩增基因组中的sgRNA所对应的DNA序列，并对扩增后的DNA序列进行二代测序。PCR产物属于碱基不平衡文库，为了减少碱基不平衡对测序结果的影响，测序时混入5%的phix文库。测序采用 Hiseq Xten-PE150 策略，测序数据量要求不低于1000个拷贝的文库sg RNA 序列数，最终数据量为2Gclean data/文库。 测序过程由北京诺禾致源生物有限公司完成。在python中分析实验组较对照组sgRNA富集的序列与对应的基因。