[发明专利]一种磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用，本发明以包含tau蛋白的217位苏氨酸(T217)磷酸化的抗原序列免疫复合物和包含tau蛋白412～434位氨基酸的抗原序列免疫复合物进行动物免疫，制备出磷酸化Tau pT217蛋白的单克隆抗体和tau(412～434)蛋白多克隆抗体，所述磷酸化Tau pT217蛋白的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株Tau‑6G12分泌得到，具有特异性强、与抗原结合力高等优点；之后选择性的以磷酸化Tau pT217蛋白的单克隆抗体作为捕获抗体，以tau(412～434)蛋白多克隆抗体作为检测抗体，使得建立的ELISA试剂盒在检测时，灵敏度更高；另外，所述试剂盒检测范围为1.17～800pg/mL，检测下限为1.17pg/mL，具有灵敏度高、检测范围广的优点。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是以进行性加重的智能衰退为临床特征的神经变性疾病，是老年痴呆发生的最主要原因。AD致病的主要原因是由于大脑中Tau蛋白过度磷酸化导致神经元缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)和大脑中β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)大量沉积构成老年斑，进而导致神经元功能异常。

Tau蛋白是脑内一种功能蛋白，在成熟正常人脑内含2～3个磷酸化位点，Tau蛋白基因位于17号染色体，由于tau蛋白mRNA的剪辑方式不同可表达出含352～441个氨基酸的6种同构异构体，它是含量最高的微管相关蛋白，大量存在于中枢系统及其周围的神经细胞内，它的作用之一是与微管蛋白相结合以促进其聚合形成微管，另外，还可以加强微管的动力学稳定性，降低微管蛋白的解离，诱导微管成束，而其本身不易被磷酸化。而微管是维持神经细胞骨架完整及神经细胞体和轴突物质转运所必须的结构。相反，AD脑内的tau蛋白(即PHF-Tau)磷酸化的位点却很多，而且PHF-Tau不与微小管结合，极易发生磷酸化。异常磷酸化和异常糖基化的tau蛋白是脑内神经元纤维缠结(NFT)中双股螺旋丝(PHF)的主要成分之一，高磷状态下的tau蛋白连接微小管的作用大为降低，且可自动聚集成成对的螺旋丝(PHF)，PHF聚集在AD患者脑受累神经元中形成NFT，成为AD特征性病理改变之一。

许多研究表明，在阿尔茨海默病及其他tau蛋白引起的病理过程中，tau蛋白的过度磷酸化可能发生在最早期，发生在tau蛋白的181位苏氨酸(T181)磷酸化，是最常见的磷酸化形式之一。文献(Palmqvist S,Janelidze S,Q Uiroz Y,et al.DiscriminativeAccuracy of Plasma Phospho-tau217 for Alzheimer Disease vs OtherNeurodegenerative Disorders[J].JAMA The Journal of the American MedicalAssociation,2020,324(8).)中发现了发生在tau蛋白的217位苏氨酸(T217)磷酸化是AD患者早期的标志诊断物，因此，如果能快速检测出磷酸化Tau pT217蛋白，就能在早期诊断出阿尔茨海默病，这对于预防和治疗阿尔茨海默病具有重要的意义。目前，市面上只有极少数厂家开发出检测磷酸化Tau pT217蛋白的试剂盒，但存在检测灵敏度不高、特异性不强等问题。

有鉴于此，有必要开发一种检测人磷酸化Tau pT217蛋白的ELISA试剂盒来解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种磷酸化Tau pT217蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用，本发明将包含tau蛋白的217位苏氨酸(T217)磷酸化的抗原序列免疫复合物和包含tau蛋白412～434位氨基酸的抗原序列免疫复合物进行动物免疫，制备出磷酸化Tau pT217蛋白的单克隆抗体和tau(412～434)蛋白多克隆抗体，分别作为捕获抗体和检测抗体用于ELISA双抗夹心试剂盒中，并且建立了磷酸化Tau pT217蛋白的检测试剂盒使用方法及其应用。