[发明专利]用于空间转录组测序的组织透化方法

说明书

本发明提供一种用于空间转录组测序的组织透化方法，包括组织贴片、固定及染色，组织透化，荧光cDNA合成，组织移除和荧光扫描成像等步骤。利用该方法可对组织样本进行透化，逆转录及组织移除，并根据荧光信号选择最优透化条件。该方法与传统方法相比，优点在于兼容范围广，操作性强，重复性好，成本低等。该方法主要应用于空间转录组的组织优化流程。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种用于空间转录组测序的组织透化方法。

背景技术

在多细胞生物中，单个细胞的基因表达严格按特定的时间和空间顺序发生，即基因表达具有时间特异性和空间特异性。时间特异性可以通过对不同时间点的样本取材，使用单细胞转录组测序技术来解析时间维度上细胞类型和基因表达模式。空间特异性信息则相对较难获得。常规转录组测序和单细胞转录组测序都难以还原细胞所处的原始位置信息。传统的原位杂交技术又很难实现高通量检测。因此发展空间转录组技术实现细胞的位置信息的保留尤为必要。

空间基因组学仍是一个新兴发展领域，市场主要有三个商业化的参与者10xGenomics，Nanostring，Readcoor。2019年12月，10x Genomics宣布收购Spatial一年之际，Visium平台正式推出，成为了第一款走入商业化进程的空间转录组产品。它的优势在于组织兼容性强，无偏性捕获所有mRNA；易与其他病理分析的方法和工具整合，也易和NGS流程整合，平台具有较强的扩展性，容易被接受整合进现有的实验室。NanoString于2019年推出GeoMx DSP，用于组织切片空间原位高通量蛋白和基因的表达检测。它与10x Visium相比，工作流程更加自动化，对于样本质量要求低，无需高质量的RNA，同时适用于FFPE，但它是一种灵活性较低的专用平台，抗体和探针的设计明确针对肿瘤免疫和神经科学的具体应用。ReadCoor最早在2020年的AGBT大会上推出，它相较于10X平台最大的优势在于无与伦比的细胞分辨率。但以上三种平台的共性为价格昂贵，其中广泛应用的10x Visium平均市场价格为3.5万元一个样本。

组织优化玻片用于摸索某个组织类型的最佳透化时间。组织优化玻片上的oligo没有spatial barcode，也不会构建测序文库，当合成一链cDNA时，在反应体系中加入带有荧光基团的核苷酸，这样合成出来的cDNA就带有荧光。通过荧光强度可以反映出组织中mRNA释放量的多少，从而确定某个组织类型最佳的透化时间。通常情况下，选择荧光信号最强、RNA扩散最少、内部组织结构最清晰的时间点作为最佳透化时间点。如果发现荧光信号发生扩散，说明透化时间过长。在确定最佳透化时间之后，就可以使用最佳透化时间开始空间基因表达的正式实验。因此，合适的组织透化工艺条件成为实现该技术的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于空间转录组测序的组织透化方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种用于空间转录组测序的组织透化方法，包括以下步骤：

(1)组织贴片、固定及染色：将新鲜冷冻组织切片贴于生物芯片指定区域，然后将芯片放入固定液中固定，并进行HE染色及扫描仪成像；

其中，所述生物芯片带有mRNA捕获探针；

(2)组织透化：将步骤(1)所得芯片放入组织透化液中孵育一段时间后，去除组织透化液(然后向芯片孔内加入0.1×SSC溶液)；

其中，所述组织透化液的组成如下：组织透化原液60μl+0.1M HCl 5940μl；所述组织透化原液的配制方法为：将0.1g胃蛋白酶溶于1000μl无核酶水中；

(3)荧光cDNA合成：(去除芯片孔内0.1×SSC溶液)向芯片孔内加入含有荧光基团的cDNA合成试剂进行cDNA合成；

(4)组织移除：去除cDNA合成试剂，向芯片孔内加入组织移除液；

(5)荧光扫描成像。