[发明专利]鲤TLR4鼠抗血清的制备方法及应用

权利要求书

1.鲤TLR4鼠抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤S1：鲤TLR4基因开放阅读框的克隆

Trizol提取鲤肠组织总RNA，经1.0wt％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，随后用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链，于-80℃保存备用，根据GenBank数据库中已报道的TLR4基因序列设计第一对特异性引物TLR4-ORF-F和TLR4-ORF-R，进行PCR扩增获得鲤TLR4基因开放阅读框片段，其中第一对特异性引物为：

上游引物TLR4-ORF-F的引物序列为5'-ATGACTTTCTTTACTATTACTGAGA-3'；

下游引物TLR4-ORF-R的引物序列为5'-TTATTGGTTTGTAGCAATAATA-3'；

步骤S2：鲤TLR4基因重组表达载体的构建

根据鲤TLR4基因ORF全长cDNA序列设计第二对特异性引物TLR4-YHBD-F和TLR4-YHBD-R，并分别在上、下游引物添加BamH I和Hind III酶切位点，再以鲤cDNA为模板，TLR4-YHBD-F和TLR4-YHBD-R分别为上、下游引物，进行PCR扩增，将PCR产物经胶回收后和pET-32a(+)表达载体进行双酶切，胶回收纯化，经T4酶连接后转入克隆感受态DH5α，获得重组表达载体pET-32a(+)-TLR4，其中第二对特异性引物为：

上游引物的引物序列为5′-CGGGATCCAGATGCCAAATCAAGCAC-3′；

下游引物的引物序列为5′-CCAAGCTTAGCAGCAGATGAAACAAAG-3′；

其中下划线部分为酶切位点；

步骤S3：鲤TLR4重组蛋白的诱导表达、纯化及Western Blot特异性分析

将步骤S2得到的重组表达载体pET-32a(+)-TLR4转入表达感受态BL21(DE3)，在含有氨苄抗性的LB培养液中于37℃培养至OD值为0.5-0.6时，加入IPTG进行诱导培养，经离心收集菌体、PBS重悬后加入5×上样缓冲液沸水浴10min，经12wt％SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况，并做相应的对照组；

以1wt％的接种量将能表达重组蛋白的菌液添加到含有氨苄抗性的LB培养基中，扩大培养，于37℃培养至OD值为0.5-0.6时，加入IPTG进行诱导培养，将诱导培养好的菌液离心，收集菌体用变性结合缓冲液重悬浮后采用超声波破碎的方法获得融合蛋白的包涵体，借助变性洗脱缓冲液通过His Trap HP柱对融合蛋白进行纯化，并用透析方法去除融合蛋白溶液中的CH₄N₂O和C₃H₄N₂盐离子，获得纯化的鲤TLR4重组蛋白；

步骤S4：鲤TLR4鼠抗血清的制备

将步骤S3纯化的鲤TLR4重组蛋白作为抗原，蛋白质浓度用0.85wt％的生理盐水调整为500μg/mL后对小鼠进行5次免疫，按体积比1:1的比例加入弗氏佐剂，初次免疫选用复试完全佐剂，采用腹部皮下多点注射，随后每隔1周加强免疫1次，共免疫5次，加强免疫选用弗氏不完全佐剂，末次免疫10天后进行全血分离，收集鼠抗血清，纯化得到鲤TLR4鼠抗血清。

2.根据权利要求1所述的鲤TLR4鼠抗血清的制备方法，其特征在于：步骤S1中所述第一对特异性引物进行PCR扩增时，每25μL的PCR扩增的反应体系包括ddH₂O 9.5μL、PremixTaqTM 12.5μL、TLR4-ORF-F 1.0μL、TLR4-ORF-R 1.0μL和cDNA 1.0μL；所述第一对特异性引物进行PCR扩增时的反应条件为：95℃预变性5min；35次循环中包括94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸3min；最后72℃延伸10min。