[发明专利]鲤TLR4鼠抗血清的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种鲤TLR4鼠抗血清的制备方法及应用，黄河鲤TLR4鼠抗血清的制备方法包括鲤TLR4基因开放阅读框的克隆；鲤TLR4基因重组表达载体pET‑32a(+)‑TLR4的构建；鲤TLR4重组蛋白的诱导表达、纯化及Western Blot的特异性分析；鲤TLR4鼠抗血清的制备。本发明采用分子生物学和基因工程的方法构建了鲤TLR4基因的重组表达载体，诱导表达，亲和层析获得纯化的重组表达蛋白。本发明制备的鲤TLR4鼠抗血清可用于（荧光）免疫组化、蛋白印迹和酶联免疫吸附等实验要求，建立体外免疫分析、研究鲤TLR4的功能以及鲤免疫荧光染色激光共聚焦显微观察，还可用于其他鲤科鱼类TLR4的免疫检测。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鲤Toll样受体4鼠抗血清的制备方法及应用。

背景技术

Toll基因由Nusslein-Volhard及其团队于1980年在进行果蝇相关研究的过程中被发现，并为其命名。研究显示，该受体在抗细菌、真菌等病原体中发挥着不可替代的作用，并且参与转导了抗菌感染易感性信号。Toll样受体4(Toll-Like Receptor 4，TLR4)是TLR家族中不可或缺的一份子，在先天性免疫中具有无可替代的地位。存在于哺乳动物体内的TLR4主要识别的受体是LPS，但TLR4并不能直接识别相应的配体，TLR4需要LBP、MD-2和CD14一起协同作用才能识别LPS。由于识别LPS的唯一受体是TLR4/MD-2复合物，因此TLR4首先需要与辅助受体MD-2结合，形成TLR4/MD-2受体复合物后才能与LPS结合。LBP是可溶性蛋白，在其结合LPS后再与CD14结合，然后CD14再将LPS转移到唯一受体TLR4/MD-2复合物上进而启动下游的信号通路。

研究发现鱼类中LPS不能诱导TLR4进行表达，鱼体内也没有CD14和MD-2。所以鱼体中可能存在别的受体可以识别LPS。但在草鱼中，病毒可以诱导TLR4进行表达，所以在鱼类中TLR4虽然不能识别LPS但可以识别病毒。鲤是我国主要的经济淡水鱼类，在我国具有较大的养殖规模。然而，在养殖过程中细菌性疾病已成为制约鲤养殖业进一步发展的限制因素。因此，深入研究鲤的免疫机制，有助于建立提高鲤机体免疫的方法，对鲤养殖业的健康发展具有重要意义。哺乳动物的研究中，关于Toll样受体大多是蛋白水平的检测。由于水产上缺少相应的抗体，致使在目前的探究实验中水产动物在Toll样受体的检测大部分局限于mRNA水平，限制了进一步的深入研究。

为了解决这一技术问题，从鲤中克隆获得TLR4基因，通过原核表达和免疫小鼠的方法制备鲤TLR4鼠抗血清，通过免疫组化实验，对该抗血清的特异性进行检验，并分析其在肠道中的表达情况，对进一步研究TLR4在宿主肠道中的免疫功能具有重要意义。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种鲤TLR4鼠抗血清的制备方法及应用，该方法制备的鲤TLR4鼠抗血清能够用于蛋白检测的实验要求，如(荧光)免疫组化、蛋白印迹和酶联免疫吸附等，建立体外分析、研究鲤TLR4的功能以及鲤免疫荧光染色激光共聚焦显微观察，还可用于其他鲤科鱼类TLR4的检测。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，鲤TLR4鼠抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤S1：鲤TLR4基因开放阅读框的克隆

Trizol提取鲤肠组织总RNA，经1.0wt％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，随后用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链，于-80℃保存备用，根据GenBank数据库中已报道的TLR4基因序列设计第一对特异性引物TLR4-ORF-F和TLR4-ORF-R，进行PCR扩增获得鲤TLR4基因开放阅读框片段，其中第一对特异性引物为：

上游引物TLR4-ORF-F的引物序列为5'-ATGACTTTCTTTACTATTACTGAGA-3'；

下游引物TLR4-ORF-R的引物序列为5'-TTATTGGTTTGTAGCAATAATA-3'；