[发明专利]一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法

权利要求书

1.一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)嗜冷菌发酵液离心，制备发酵液样品；

(2)配置含有蛋白底物的SDS-PAGE凝胶；

(3)将发酵液样品与蛋白上样缓冲液混匀后上样；

(4)电泳；

(5)取出凝胶，用预冷的洗脱液进行凝胶洗脱；

(6)将凝胶在孵育缓冲液中孵育；

(7)考马斯亮蓝染色。

2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法，其特征在于，步骤(1)中，将嗜冷菌接种至发酵培养基，培养48h，培养结束后发酵液在4℃、8000rpm离心5min，制备发酵液样品。

3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法，其特征在于，步骤(2)中，含有蛋白底物的SDS-PAGE凝胶制备过程如下：

首先配置12.5％分离胶，将混匀后的分离胶加入蛋白电泳仪的垂直玻璃板电泳槽，当分离胶冷凝成型后，加入配置好的5％浓缩胶至玻璃板刻度，插入电泳梳子，室温放置等待浓缩胶冷凝，拔出电泳梳子；

12.5％分离胶配方为：30％(v/v)聚丙烯胺，4mL；1.5mol Tris，2.5mL；10％(w/v)SDS，0.1mL；10％(w/v)过硫酸铵，0.1mL；TEMED，4μL；蛋白底物，250μL；H₂O，3.55mL；

5％浓缩胶配方为：30％(v/v)聚丙烯胺，0.5mL；1.0mol Tris，0.38mL；10％(w/v)SDS，0.03mL；10％(w/v)过硫酸铵，0.03mL；TEMED，3μL；H₂O，2.1mL。

4.根据权利要求1所述的一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法，其特征在于，步骤(2)中，蛋白底物选择为酪蛋白或明胶。

5.根据权利要求1所述的一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法，其特征在于，步骤(3)中，将发酵液样品分成两份，一份经过90℃水浴处理5min，一份不进行热处理，分别与非还原性蛋白上样缓冲液混匀后上样。

6.根据权利要求1所述的一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法，其特征在于，步骤(3)中，非还原性蛋白上样缓冲液配方如下：60mmol/L Tris-HCl，25％(v/v)甘油，2％(w/v)SDS，0.1％(w/v)溴酚蓝。

7.根据权利要求1所述的一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法，其特征在于，步骤(3)中，将发酵液样品与非还原性蛋白上样缓冲液按4:1(v/v)混匀后进行上样。

8.根据权利要求1所述的一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法，其特征在于，步骤(4)中，电泳条件为4℃160V运行1h；

电泳缓冲液配方如下：Tris 3g/L，甘氨酸14.4g/L。

9.根据权利要求1所述的一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法，其特征在于，步骤(5)中，电泳结束后取出凝胶，用预冷的洗脱液在冰上洗脱凝胶两次，每次30min；

步骤(5)中，洗脱液配方为：50mM Tris，5mM CaCl₂，0.02％(w/v)Brij 35，2.5％(v/v)TritonX-100，pH 7.5；

步骤(6)中，凝胶洗脱完毕后，放置于孵育缓冲液中37℃孵育3h，孵育缓冲液配方为：50mM Tris，0.2M NaCl，5mM CaCl₂，0.02％(w/v)Brij 35，pH 7.5。

10.根据权利要求1所述的一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法，其特征在于，步骤(7)中，考马斯亮蓝染色后，比较发酵液样品经过热处理和不经过热处理的蛋白酶条带，判断蛋白酶种类，以及判断蛋白酶是否耐热。