[发明专利]一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法

说明书

本发明涉及一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法，包括以下步骤：(1)嗜冷菌发酵液离心，制备发酵液样品；(2)配置含有蛋白底物的SDS‑PAGE凝胶；(3)将发酵液样品与蛋白上样缓冲液混匀后上样；(4)电泳；(5)取出凝胶，用预冷的洗脱液进行凝胶洗脱；(6)将凝胶在孵育缓冲液中孵育；(7)考马斯亮蓝染色。与现有技术相比，本发明方法能对嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类进行快速定性，能够良好的区分不同分子量耐热蛋白酶，比传统方法能够更加准确的对耐热蛋白酶种类进行定性，省去了繁琐的蛋白酶分离纯化步骤，重复性好，灵敏度较高，可以用于不同嗜冷菌胞外耐热蛋白酶的检测，应用空间广泛。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法。

背景技术

由于奶牛乳房、挤奶设备和挤奶室环境存在微生物，原料乳极易受到嗜冷菌等微生物的污染。嗜冷菌污染在原料乳加工中普遍存在，危害主要表现为嗜冷菌产生具有耐热性胞外酶，能水解牛奶中蛋白质、脂肪和磷脂等营养物质。特别是牛奶储藏时间过长或者高温杀菌后温度没有及时降低，嗜冷菌快速生长并产生大量蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶，它们能分解乳制品中的脂肪、蛋白质和卵磷脂，导致产品凝结、分层、产生苦味等不良性状，严重影响产品货架期。耐热蛋白酶能够水解a-casein和β-casein，破坏乳脂肪球和酪蛋白表面结构，引起脂肪与脂肪、脂肪与酪蛋白结合并聚集，形成小薄片浮于奶上层。嗜冷菌蛋白酶具有高热稳定性和强复性能力，在高温处理后，没有完全灭活的蛋白酶分子可以重新折叠形成具有空间活动的螺旋结构。乳品保藏过程中蛋白酶会分解蛋白质，导致乳品感官品质和物理环境化学结构性质变化，降低乳品营养价值，缩短产品保质期。

为确保乳制品保质期，嗜冷菌所产耐热胞外蛋白酶活力及种类的检测至关重要。胞外蛋白酶主要有甲醛法、茚三酮法、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法、邻苯二甲醛(OPA)法及Folin-酚法等方法进行检测。这些方法过检测蛋白水解底物的方式进行检测，检测流程较为复杂，且不能有效的检测与鉴定嗜冷菌所产耐热胞外蛋白酶种类。

发明内容

针对常规检测方法流程较为复杂，且不能有效的检测与鉴定嗜冷菌所产耐热胞外蛋白酶种类的问题，本发明提供一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法。

本发明提供的方法不用对嗜冷菌胞外蛋白酶进行分离纯化，显著提高了检测效率，能够实现嗜冷菌胞外耐热蛋白酶的高通量快速、准确检测。

本发明可以快速、准确的鉴定嗜冷菌胞外耐热酶的种类以及分子量，对于准确了解嗜冷菌的产酶特性以及危害有着重要的作用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种快速鉴定嗜冷菌胞外耐热蛋白酶种类的方法，包括以下步骤：

(1)嗜冷菌发酵液离心，制备发酵液样品；

(2)配置含有蛋白底物的SDS-PAGE凝胶；

(3)将发酵液样品与蛋白上样缓冲液混匀后上样；

(4)电泳；

(5)取出凝胶，用预冷的洗脱液进行凝胶洗脱；

(6)将凝胶在孵育缓冲液中孵育；

(7)考马斯亮蓝染色。

在本发明的一个实施方式中，进一步地，步骤(1)中，将嗜冷菌接种至发酵培养基，在相应的培养条件下培养48h，培养结束后发酵液在4℃、8000rpm离心5min，制备发酵液样品。

在本发明的一个实施方式中，进一步地，步骤(2)中，含有蛋白底物的SDS-PAGE凝胶制备过程如下：