[发明专利]用于川崎病检测的引物组、探针及试剂盒

说明书

本发明提出了一种用于川崎病检测的引物组、探针及试剂盒，属于分子生物学技术领域，包括反转录引物、扩增引物和探针序列，所述核酸序列组合能够有效定性/定量检测人血液血小板中的miR‑125a‑5p、hsa‑miR‑3182、hsa‑miR‑3675‑5p、miR‑4433b‑5p和miR‑126，其中miR‑126作为内参标志物。本发明采集的是血小板中的miRNA，血小板相较于外泌体而言更易获得，且含量丰富，提取方法简单。本发明设置了特异性的miRNA内参基因，方法更为合理，联合分析4种miRNA，准确度远远大于单一生物标准物的检测，降低假阳性的发生，更易区分川崎病与普通发热等情况。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及miRNA应用技术领域，特别指一种用于川崎病检测的引物组、探针及试剂盒。

背景技术

川崎病(Kawasaki disease，KD)于1967年由日本川崎富作首先报告，曾被称为皮肤黏膜淋巴结综合征(mucocutaneous lymphnode syndrome ,MCLS)，是一种原因未明的急性、自限性全身免疫性血管炎。它主要发病年龄为6个月～4岁，其特征为广泛的中小血管炎，以心血管系统的损害最为严重，主要累及冠状动脉，大约15％～25％未经治疗的儿童最终发展为冠状动脉损害，使其成为发达国家儿童获得性心脏病最常见的原因。研究认为，KD急性期、恢复期均存在长期的血管内皮功能紊乱，成为成人易患冠状动脉粥样硬化的危险因素。2004年美国心脏病协会提出：KD恢复后血管内皮功能持续性障碍，可能是冠心病发生的新的危险因素。

川崎病作为一种急性、自限性的全身性血管炎，主要临床表现为发热、口腔黏膜改变、皮疹、颈部淋巴结肿大、球结膜充血和肢端改变等。其特征为广泛的中、小血管炎症，以心血管系统损害最为严重，组织病理表现包括全血管炎、内皮坏死、单核细胞浸润中、小血管等。如果未及时经正规治疗，25％～30％的患儿会出现冠状动脉病变；而早期应用静脉大剂量丙种球蛋白(IVIG)～将冠状动脉瘤的发生率降低到3％～5％左右。由于川崎病的早期最主要的症状是高者热程超过5天，易与颈淋巴结炎、猩红热、荨麻疹、败血症等其他发热性疾病混淆而产生误诊，据相关文献报道，川崎病的早期误诊率可高达26.7％，使误诊患儿不能在川崎病早期及时使用IVIG进行联合治疗而导致后期的冠状动脉损伤。

血小板作为血液中第二丰富的细胞类型，血小板是由骨髓造血组织中的巨核细胞产生。多功能造血干细胞在造血组织中经过定向分化形成原始的巨核细胞，又进一步成为成熟的巨核细胞。成熟的巨核细胞膜表面形成许多凹陷，伸入胞质之中，相邻的凹陷细胞膜在凹陷深部相互融合，使巨核细胞部分胞质与母体分开。最后这些被细胞膜包围的与巨核细胞胞质分离开的成分脱离巨核细胞，经过骨髓造血组织中的血窦进入血液循环成为血小板。存在于外周血液循环中的血小板,在机体中起着止血和伤口愈合作用。

近年来研究发现，血小板已成为全身和局部反应的中心分子，在细胞交流和免疫反应中扮演了重要作用，并且由于血小板没有细胞核，在研究其RNA时不会存在rRNA的背景干扰。血小板在免疫反应中也起到了信号交流和转移传播的作用，由于川崎病是一种全身性的免疫性疾病，所以研究血小板RNA对川崎病的早期诊断有着理论基础和实际意义，而目前关于这方面的研究报道非常少见。

专利CN 106701962 A用于川崎病检测的引物组、探针及试剂盒提供一种用于川崎病检测的核酸序列组合，包括反转录引物、扩增引物和探针序列，所述核酸序列组合能够有效定性/定量检测人血清中的hsa-miR-197、hsa-miR-671、hsa-miR1246和hsa-miR4436。该专利从血清样品获取外泌体miRNA进行检测，而血液中的血清获取需要等待一定时间，且外泌体本身不易获取，外泌体miRNA的含量较少，提取外泌体miRNA操作复杂，提取成本较高，且外泌体miRNA的检测难度大。该专利中并未设置内参基因，在后期实验中可能存在个体差异。