[发明专利]一种口服55型腺病毒疫苗制备方法及应用

权利要求书

1.一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：包括下述步骤：

1）从感染者咽拭子标本中分离出55型腺病毒源，采用HEp-2细胞培养法进行分离培养；

2）55型腺病毒的无血清培养；

3）55型腺病毒的纯化。

2.如权利要求1所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：所述步骤1）包括下述具体步骤：

1.1）体外培养HEp-2细胞，传代培养3次，采用生长状态良好的HEp-2细胞接种24孔板，接种密度1.5×10⁵个/孔，在37 ℃ 5% CO₂孵箱中培养18~24h；

1.2）弃去细胞培养基，用PBS洗涤细胞3次，每孔加入300μl含2%FBS的RPIM 1640培养基，并加入咽拭子标本100μl/孔，置于37℃ 5% CO₂饱和湿度孵箱内孵育6 h，弃去孵育液，更换为含2%FBS的RPIM 1640培养基500μL；

1.3）持续培养并逐日观察细胞生长状态，当75%以上的细胞出现典型细胞病变效应时，收集细胞上清，5000×g离心5min去除细胞碎片，取上清病毒液保存。

3.如权利要求1所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：所述步骤2）具体为：将步骤1）所得利用无血清悬浮培养的Vero细胞，培养至5×10⁶cells/mL，接种55型腺病毒，培养至75%以上的细胞出现典型细胞病变效应时，收集培养液。

4.根据权利要求1所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：所述步骤3）包括下述具体步骤：

3.1）取步骤2）所得，以5000×g离心力离心5min，用移液管吸取离心后的上清，加入10000MWCO超滤管中，以5000×g离心力离心20min；

3.2）在步骤3.1）的浓缩液中加入无菌PBS至原体积；

3.3）经步骤3.2）后，以5000×g离心力离心20min；

3.4）重复步骤3.2）、步骤3.3）3次，吸取浓缩液于无菌管中，即得到纯化的55型腺病毒。

5.根据权利要求4所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：还包括对55型腺病毒的检测，具体为：采用病毒核酸提取试剂盒提取离心后的上清中病毒DNA，采用荧光定量PCR方法进行核酸检测。

6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：还包括将纯化后的55型腺病毒保存于-70℃冰箱内。

7.根据权利要求1或2或3或4或5所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法，其特征在于：所述55型腺病毒的分离培养在BSL-2实验室完成。

8.一种口服55型腺病毒疫苗的应用，其特征在于：如权利要求1~7任一项所述的一种口服55型腺病毒疫苗制备方法所制备的口服55型腺病毒疫苗在55型腺病毒方面的口服免疫应用。