[发明专利]基于双功能融合蛋白的真菌毒素磁化学发光免疫分析试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种真菌毒素磁化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括链霉亲和素磁微粒、生物素标记的真菌毒素抗原、真菌毒素标准品溶液、真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白、样本稀释液、洗涤液、底物液；

所述真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白是以碱性磷酸酶作为生物发光的催化剂，将真菌毒素纳米抗体与碱性磷酸酶融合表达获得；所述真菌毒素纳米抗体选自骆驼科或鲨鱼科动物的重链抗体；

所述真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如以下中的任一种或多种：

黄曲霉毒素B1纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

脱氧雪腐镰刀菌烯醇纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；

玉米赤霉烯酮纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

T-2毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

伏马毒素B1纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

赭曲霉毒素A纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白是通过下述方法制备的：

(1)真菌毒素纳米抗体基因的设计与合成：根据真菌毒素纳米抗体的氨基酸序列，通过优化基因的结构实现基因在大肠杆菌中的高效表达，包括使用大肠杆菌偏爱密码子，消除可能存在的二级结构，使GC/AT均衡，设计并合成真菌毒素纳米抗体基因的核苷酸片段；

(2)真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合表达载体的构建：将步骤(1)合成的真菌毒素纳米抗体基因与碱性磷酸酶基因克隆到原核表达载体中，构建真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合表达载体；

(3)真菌毒素纳米抗体-碱性磷酸酶双功能融合蛋白的表达：将双功能融合表达载体转化至表达菌株E.coli BL21或Rosetta DE3的感受态细胞中，诱导表达，收集菌体细胞，加入菌体蛋白提取试剂，离心收集含有可溶性蛋白的上清液；

(4)双功能融合蛋白的纯化：采用Ni²⁺-NTA亲和层析柱进行融合蛋白的纯化。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒是以四氧化三铁或三氧化二铁超顺磁性材料为内核，外围包覆聚苯乙烯或葡聚糖，通过物理或化学的方法活化使磁微粒表面产生氨基、甲苯磺酰基、羧基或环氧基基团，粒径为1-2μm。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁微粒是将链霉亲和素与磁微粒偶联。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的真菌毒素抗原是先将真菌毒素和牛血清白蛋白偶联，再将得到的牛血清白蛋白-真菌毒素复合物和生物素偶联。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述真菌毒素标准品溶液是将真菌毒素标准品溶于甲醇-水混合溶液中配制而成。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述甲醇-水混合溶液中，甲醇与水的体积比为20:80-80:20。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底物液是浓度为0.5-2mmol/L的(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐溶液。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液由0.01M磷酸盐缓冲液、0.1％吐温20和0.5％牛血清白蛋白组成。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液由0.01MTris-HCl缓冲液和0.1％吐温20组成。