[发明专利]特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针及其制备方法与应用

权利要求书

1.特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针，其特征在于，所述体外特异性探针的结构式如下所示其中R₁为时，所述体外特异性探针的结构式为时，记为CL-TCO，所述体外特异性探针与MAO-A特异性结合；或R₁为时，所述体外特异性探针的结构式为记为PA-TCO，所述体外特异性探针与MAO-B特异性结合。

2.基于权利要求1所述的特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针的制备方法，其特征在于，当R1为时，所述体外特异性探针的结构式为记为CL-TCO，具体的制备方法如下：第一步：将2-氯-4-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)苯酚1eq.和叔丁基二甲基氯硅烷1.5eq.溶于二氯甲烷中，在冰浴和氮气保护下加入滴加三乙醇胺，反应4-10h，反应结束后加水用二氯甲烷萃取，有机相用1M稀盐酸洗涤，加入无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到叔丁基(2-氯-4-甲基苯氧基)二甲基硅烷；第二步：将叔丁基(2-氯-4-甲基苯氧基)二甲基硅烷1eq.溶于四氯化碳中，在冰浴条件下加入N-溴代丁二酰亚胺1eq.，加热回流3h，加水萃取，无水硫酸钠干燥，得到(4-(溴甲基)-2-氯苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷；第三步：将反式环辛烯醇1.5eq.溶于N,N-二甲基甲酰胺，在冰浴条件下缓慢加入氢化钠2eq.，室温下搅拌30min后加入4-羟基反式环辛烯1eq.，反应5-10h；反应结束后，加入水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到(E)-叔丁基(2-氯-4-((环辛-4-烯-1-基氧基)甲基)苯氧基)二甲基硅烷；第四步：将(E)-叔丁基(2-氯-4-((环辛-4-烯-1-基氧基)甲基)苯氧基)二甲基硅烷1eq.溶于四氢呋喃中，在冰浴条件下，滴加四丁基氟化铵1.2eq.，室温下搅拌2-10h，反应结束后加入水淬灭，用二氯甲烷萃取；用无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到(E)-2-氯-4-((环辛-4-烯-1-丙氧基)甲基)苯酚；第五步：将(E)-2-氯-4-((环辛-4-烯-1-丙氧基)甲基)苯酚1eq.、1,3-二溴丙烷2eq.溶于乙腈中，加入碳酸钾1eq.在氮气保护下回流3h，冷却至室温后加入N-甲基丙-2-胺3eq.和碳酸钾3eq.40℃搅拌22-48h；旋干溶剂，用水和乙酸乙酯萃取；无水硫酸钠干燥；通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到最终化合物CL-TCO；当R1为时，所述体外特异性探针的结构式为记为PA-TCO，具体的制备方法如下：在冰浴条件下，将4-羟基反式环辛烯和吡啶1.2eq.溶于二氯甲烷,缓慢滴加4-硝基苯基碳酰氯1.2eq.室温下搅拌10-20h，反应完全后加水和二氯甲烷萃取，有机相用1M碳酸钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到(E)-环辛-4-烯-1-基(4-硝基苯基)碳酸酯；第二步：将2-溴乙-1-胺6eq.溶于二氯甲烷中，在氮气保护下，缓慢滴加(E)-环辛-4-烯-1-基(4-硝基苯基)碳酸酯1eq.室温下搅拌14-22h，反应完全后加入萃取；有机相用碳酸氢钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到(E)-环辛-4-烯-1-基(2-溴乙基)氨基甲酸酯；第三步：将4-羟基苯甲醛1eq.溶于四氢呋喃中，在氮气保护下，加入4-羟基苯甲醛-1 1.2eq.反应混合物在室温下搅拌30min后，加入醋酸钠1.4eq.反应4-10h，饱和碳酸氢钠淬灭反应混合物，用乙酸乙酯4x20 mL萃取，合并有机层，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到4-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)苯酚；第四步：将4-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)苯酚1eq.、(E)-环辛-4-烯-1-基(2-溴乙基)氨基甲酸酯1.2eq.、碳酸钾2eq.溶于乙腈溶液中，氮气保护下加热回流10-20h，反应完全后，旋干溶剂，加入1M稀盐酸调pH至7.0，加入二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到最终产物PA-TCO。

3.基于权利要求1或2中所述的活性小分子探针在检测单胺氧化酶A/B的应用，其特征在于，特异性探针的反式环辛烯结构通过与带有1,2,4,5-四嗪结构的染料发生生物正交反应，产物会产生强的荧光，再通过荧光变化测定不同生物体系中单胺氧化酶A/B的活性，将特异性结合的蛋白-探针溶液与带有1,2,4,5-四嗪结构的染料溶液等体积反应，其中被特异性探针修饰的蛋白溶液浓度为1,2,4,5-四嗪结构的染料溶液浓度的5-50倍，反应时间为5-30min，反应温度为20-37℃，测定单位时间内反应的荧光值作为单胺氧化酶A/B活性的评价指标。